瓦松愈伤组织反应器高效培养机制和提取物的药理活性研究

Orostachys has a high medicinal value, the material source of extracts and pharmaceutics in Orostachys is mainly dependent on the wild resource. However, the wild resource has decreased by the over-excavation. To protect the wild resource and provide a new material source for the product production of Orostachys, the present project will use the calluses of Orostachys cartilaginea as the experimental material to produce massive bioactive compounds by rapidly culturing the calluses using air-lift bioreactor systems. We will find out the bioreactor culture mechanism by studying the effects of physical and chemical factors affecting callus biomass and bioactive compound accumulation, and by exploring the kinetics of callus growth and metabolite synthesis during bioreactor culture. Moreover, we will establish a high-efficient bioreactor culture system by using biotic and abiotic elicitors which promote bioactive compound accumulation. Finally, we will use the different extracts of bioreactor-cultured calluses to study the activities of anti-oxidant, anti-inflammatory, and anti-cancer for proving the pharmacological activity of the O. cartilaginea calluses. The study of the present project can provide a reference for production of Orostachys products and also has an important guide meaning for industrial production of metabolites in other medicinal plants.

瓦松是具有较高药用价值的植物，该药材提取物或制剂的原料供应目前依赖于野生资源，但因人们过量采挖，使瓦松野生资源严重短缺。为了有效保护和持续开发利用瓦松资源并为其产品生产提供另一种原材料来源，本项目以狼爪瓦松（Orostachys cartilaginea）愈伤组织为材料，拟利用气升式生物反应器快速培养愈伤组织大量生产生物活性物质。在本项目中我们拟通过研究影响愈伤组织生物量和生物活性物质（多糖、黄酮等）积累的理化因素及愈伤组织生长、物质合成的动力学，探究反应器培养机制。为了促进生物活性物质积累，拟研究几种生物和非生物诱导子的作用效果，建立愈伤组织反应器高效培养模式。最后，通过研究愈伤组织不同提取物的抗氧化、抗炎及抗癌活性，探究愈伤组织的药理活性特性。本项目的研究可为瓦松属植物产品生产提供参考，对于其他药用植物代谢产物的工业化生产也具有重要的指导性意义。

狼爪瓦松为长白山区特种的一种药用植物，但因其野生资源逐年减少及人工栽培体系尚未建立，导致植物材料无法满足市场需求。因此，本项目利用生物反应器研究了狼爪瓦松愈伤组织的培养机制，同时对培养的愈伤组织几种生物活性进行了探究，旨在为今后将愈伤组织作为一种新植物材料应用于狼爪瓦松产品生产中。生物反应器微环境调控研究结果显示将通气量调节为150mL/min时，有利于狼爪瓦松愈伤组织生长及多糖、酚和黄酮等物质的积累；适宜接种量依据不同代谢物质而不同，表明可根据目的产物调节接种量；光照强度为30umol/cm2/s时愈伤组织生物量及代谢物质合成最多。动态学研究结果表明25d为愈伤组织生长和有效物质积累的最佳培养周期。用100uM水杨酸（SA）和100uM茉莉酸甲酯（MeJA）作为诱导子处理48h时，可显著提高有效物质的积累；过氧化氢和一氧化氮（NO）作为信号分子参与调控SA和MeJA诱导的黄酮的合成。本项目发现愈伤组织具有抗氧化、抗炎、抗癌和抑菌特性。愈伤组织粗提物可清除DPPH自由基，IC50为0.049mg/mL，同时也可清除烃基自由基，其IC50为0.11mg/mL。愈伤组织粗提物（25—200mg/mL）对小鼠巨噬细胞RAW264.7无明显毒性，12.5mg/mL的粗提物对脂多糖刺激的RAW264.7中NO分泌有显著抑制效果。另外，我们对愈伤组织粗多糖采用大孔树脂吸附法提纯，优化工艺为进料浓度1.6mg/mL、进料体积3BV、洗脱剂乙醇浓度65%、洗脱剂体积为3BV。提纯的多糖（OTP）对人结肠癌（HCT116）细胞活性具有很好的抑制效果，且促进细胞凋亡，凋亡相关蛋白Bax、Cytochrome-c、Caspase-9和Caspase-3表达也显著上升。愈伤组织粗提物和OTP均有很好的抑菌效果，尤其对致病的枯草芽孢杆菌，其抑菌机制为提高菌细胞的通透性和抑制菌呼吸代谢。综合以上结论，本研究认为利用生物反应器可在短期内大量培养富含各种活性物质的狼爪瓦松愈伤组织，而这些愈伤组织具有较好的抗氧化、抗炎、抗癌和抑菌特性，因此，愈伤组织作为一种新的植物材料应用于相关产品的工业化生产中具有极大潜力。