日本血吸虫尾蚴入侵宿主皮肤的分子机理

Penetrating skin is the initial step in successful infection to mammalian host by schistosome cercariae. Schistosome larvae have remarkable ability to degrade the host skin tissue by proteolytic enzymes released from the acetabular glands of cercariae to facilitate the entry. To date, the key molecule and mechanism of S. japonicum cercaria invasion is still unclear. In previous studies, we found an elastase encoding gene (SjCE-b2) in S. japonicum, which is homologue to the key enzyme for S. mansoni invasion (Nature, 2009). However, our further study showed that the S. japonicum elastase does not play a crucial role during the invasion as does the S. mansoni elastase. According to our recent studies, S. japonicum cercaria invasion may involve several enzymes including the members of serine protease, cysteine protease or/and metalloproteinase families, indicating the invasion mechanism is more complicated than that in S. mansoni. Thus, the questions of interest for S. japonicum remain to be clarified are which enzymes play the key role in penetrating host skin and how the potential enzymes co-act in the process. To address these questions, it is proposed that based on the previous studies by our group, we will identify the key protease components by cloning and expressing the penitential genes, analyzing the enzyme substrates with mass spectrometric technique, detecting of the enzyme activity, and localizing in cercariae. We will further verify the function of these cercaria proteases by in vivo and in vitro tests with inhibitors and immunized rabbit serum. The result of this research will reveal the key molecules and the mechanism in S. japonicum cercaria invasion and provide new clues on target antigens for development of vaccine and new drug.

血吸虫尾蚴通过腺体释放的蛋白酶降解皮肤组织进入哺乳动物体内是其成功感染的前提，但日本血吸虫侵染过程的关键分子和机制长期不明。我们前期发现日本血吸虫具有编码类似曼氏血吸虫尾蚴关键侵染分子弹性蛋白酶的基因（Nature, 2009）；进而又发现该酶分子并未在日本血吸虫中发挥类似的决定性作用，提示其侵染机制远比曼氏血吸虫复杂。我们近期的研究显示日本血吸虫尾蚴侵染宿主涉及多种酶的共同作用，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶家族成员；其中的关键问题是：哪几种酶发挥主要侵染作用？这些酶如何协同作用？据此，本项目拟利用质谱对尾蚴、尾蚴分泌物以及穿越皮肤后童虫的蛋白进行比较分析，鉴定目标蛋白酶；对目标蛋白酶进行克隆表达、酶活、定位、作用底物等进行分析；并在体内外全面验证目标尾蚴蛋白酶在入侵宿主皮肤过程中的作用。本研究将揭示日本血吸虫感染宿主的关键分子及其分子机制，为发展新的防治策略提供依据。

尾蚴入侵是血吸虫成功感染宿主的第一步，日本血吸虫参与尾蚴入侵的蛋白酶尚不清楚。为了阐明参与日本血吸虫尾蚴入侵相关的蛋白酶及其功能，本研究首先进行了子胞蚴、尾蚴转录组测序及尾蚴、童虫蛋白质组鉴定，并通过蛋白酶预测及分泌蛋白分析预测， 获得了14个在入侵过程中含量显著下降的分泌型蛋白酶候选基因。共克隆表达9个候选蛋白酶并完成了其抗体制备和定位。随后，通过了蛋白质组学鉴定日本血吸虫尾蚴穿越小鼠皮肤过程中释放的蛋白酶及降解的皮肤组分。共鉴定到尾蚴释放的40个蛋白，包括弹性蛋白酶和利氏曼溶蛋白酶，并发现宿主皮肤角蛋白、补体相关蛋白、免疫球蛋白以及蛋白酶抑制因子等多种组分被水解。进一步对4种重要入侵相关蛋白酶进行了深入研究。对组织蛋白酶B（SjCB2），在尾蚴中以酶原和活性酶的形式存在，定位于钻腺及其导管；采用荧光底物Z-FR-MCA检测SjCB2的酶活，发现该酶的最佳温度为37 °C，最适pH值为4.0，半胱氨酸蛋白酶特异性的抑制剂E-64可抑制其活性；体外蛋白酶水解实验以及人造皮肤水解实验显示，SjCB2能水解皮肤中的胶原蛋白、角蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白，以及免疫相关的免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和补体蛋白C3等29种蛋白组分，表明SjCB2可以帮助入侵的尾蚴打破皮肤屏障并躲避宿主免疫攻击；抗体抑制试验结果显示，尾蚴入侵能力下降了22.94%，直接证明SjCB2参与了尾蚴入侵过程。对弹性蛋白酶2b（SjCE2b），用毕赤酵母表达了活性的重组蛋白；荧光底物Suc-AAPF-AMC验证了其活性；体外蛋白酶水解实验以及人造皮肤水解实验显示，SjCE2b可以降解皮肤的胶原蛋白、角蛋白和纤连蛋白等54种蛋白组分，但不能降解大多数免疫相关蛋白，说明SjCE2b在尾蚴穿皮过程中主要用于破坏皮肤屏障；抗体抑制尾蚴感染实验结果显示，尾蚴入侵能力下降了80.85%，进一步证明了SjCE2b在尾蚴入侵过程中的重要租用。两个利氏曼溶蛋白酶，一个定位于钻腺和头腺，另一个定位于钻腺和表皮，具体功能正在进一步用实验验证。已发表相关SCI论文3篇。