金属硫蛋白表面展示菌阻遏川芎镉富集的机制研究

Ligusticum chuanxiong is an important genuine crude drugs in Sichuan. The problem of cadmium exceed the standard is extremly severe. Microorganisms are outstandingbiological adsorption and solid phase extraction with the characteristic of Wide range of sources, low-cost,rich binding site and high adsorption capacity。But the traditional microbial adsorbent has characteristic of the adsorption efficiency is not high and the selectivity is not strong.On the cell surface modified by genetic tools could change the functional groups on the surface of cells It could effectively improve the metal enrichment capacity and selectivity of the target metal ions.This research selects the cell surface display technology to express Metallothionein which has great adsorption effect of cadmium ion on the surface of cells. It could improve the ability of the adsorption of heavy metals of the micobe. The research would discuss the mechanism of the modified bacteria can inhibit the Ligusticum chuanxiong enrichment of cadmium in soil of cadmium ion through study on adsorption properties,immobilization effects study,adsorption sites study and soil culture experiment.The research aims to explore the internal and external factors of the influence of the concentration process, to explore the mechanism of bioaccumulation and to alleviate the enrichment of cadmium and other heavy metal exceeds of Ligusticum chuanxiong.

川芎的重金属尤其是镉超标现状十分严峻，成为目前影响药材质量的最大障碍。目前尚无有效的解决方案。微生物作为生物吸附及固相萃取材料具有成本低、来源广、结合位点丰富、吸附容量大等优势，但存在吸附效率不高，选择性不够强的缺陷。金属硫蛋白是一种高效的重金属结合短肽分子，尤其对镉具有较为优越的选择性吸附能力。申请者长期从事重金属微生物吸附研究，前期筛选到吸附镉的菌FFT3，本项目拟采用细胞表面展示技术将专属吸附镉的金属硫蛋白表达于微生物体表面，增加其重金属吸附位点和吸附容量，特别是增强其对重金属镉的选择性吸附能力。将改性菌应用于川芎的土壤镉污染治理中，旨在探索内在及外在因素对生物富集过程的影响，利用菌株在川芎根际生长的互利共生关系，缓解川芎的镉及其他重金属超标富集现象，揭示菌阻遏川芎镉吸收机制，为川芎高镉含量问题的解决提供新的思路和方法。

川芎是四川著名道地药材，具有很高的药用价值和经济价值。然而近年川芎Cd超标问题十分严峻，严重影响了其药用安全。为解决川芎镉超标问题，本研究利用了微生物作为重金属生物吸附材料，并通过细胞表面展示技术，将金属硫蛋白这一种对镉有较好选择吸附能力的高效重金属结合短肽，表达到微生物菌株表面，将其添加入川芎根际共生，以达到阻遏川芎镉富集的效果。本研究构建了金属硫蛋白的融合表达载体，并将其展示在目标菌株表面；对所构建菌株进行了耐镉与镉吸附特性研究。观察了该构建菌株在大田栽培情况下对川芎镉富集效果的影响，并评价了该菌株共生情况下，对川芎植株生长情况的影响。最后，根据上述研究结果，采 用了阻控川芎吸收土壤镉的有效措施，提高了川芎的品质。取得的主要结果如下：成功地在菌株表面显示了融合蛋白MT-Fag，同时保持了其特异性；重组菌株DH5α (pBSD-LCF)可在较高浓度（125ml/g）的镉环境下生存，外表达的金属硫蛋白明显增强了菌株的镉吸附容量，100mg/l镉溶液中，重组菌株的镉吸附效率最高可达到95.2%；扫描电镜和傅里叶红外实验也进一步显示了金属硫蛋白的存在参与了镉吸附过程，是重组菌株镉吸附的重要参与组分；重组菌株与川芎共生的土培实验表明施加了重组菌株的川芎其根茎部位镉含量降低16.7%；菌株对川芎的共生作用使得川芎的干重、鲜重、株高（在川芎生长初期的4个月之内，川芎植株株高最高提高了5%，鲜重也最高提升了6%。）以及川芎的氧化应激能力也有不同程度的提升。上述研究及其结果，为川芎 Cd 超标治理提供了针对性的理论支撑和实践依据，对于其他药用植物资源的开发应用也具有一定的借鉴意义。