森林草莓RdDM途径基因FveFDM1调控果实大小的表观遗传机理研究

DNA de novo methylation mediated by RdDM pathway is one of the important mechanisms in epigenetic regulation. The key components of RdDM pathway have been revealed in Arabidopsis studies, but whether and how this pathway regulates fruit development are largely unknown. In this study, we identified one EMS mutagenized mutant, named S229, producing smaller fruits in diploid strawberrry Fragaria vesca. Gene cloning shows that the causal gene is one of the key components in RdDM pathway, called FveFDM1 herein. In this project, we will elucidate its biological functions through gene expression analysis and comparing the fruit size and fruit quality of S229, FveFDM1-ox, and wild type control. We will try to identify the target genes of RdDM pathway in the regulation of fruit size by a combination of RNA-seq and whole genome bisulfite sequencing. We will reveal the contributions of FveFDM1 and its paralogs to DNA methylaton by comparing the phenotypes and DNA methylation levels of target sites of single and double mutants created by CRISPR/Cas9. This study would help to demonstrate the regulatory mechanism of epigenetic modifications during fleshy fruit development and provide theoretical foundations for genetic improvement of fruit crops.

RdDM途径介导的DNA初始甲基化是表观遗传调控的重要方式之一。拟南芥的研究已揭示了RdDM途径的多个重要元件，然而该途径是否以及如何调控果实发育却鲜有报道。前期研究中，申请人通过筛选二倍体森林草莓EMS人工诱导突变体库，发现S229株系的果实明显变小，基因克隆显示致突变基因是RdDM途径中的重要成员，命名为FveFDM1。本项目将通过表达模式分析和S229、FveFDM1-ox、野生型材料间果实大小和品质等方面的差异分析，阐明FveFDM1的生物学功能；通过转录组测序和全基因组DNA甲基化测序，挖掘RdDM途径调控果实大小的下游靶基因；利用CRISPR/Cas9创建FveFDM1及同家族基因单、双突变体，比较这些材料的果实大小和DNA甲基化水平，揭示家族内各基因在DNA甲基化中的贡献。本项目的研究成果将有助于揭示表观遗传修饰调控肉质果实发育的分子机理，为果树作物的遗传改良提供理论依据。

RdDM途径介导的DNA初始甲基化是表观遗传调控的重要方式之一。拟南芥的研究已揭示了RdDM途径的多个重要元件，然而该途径是否以及如何调控果实发育却鲜有报道。申请人筛选出一株森林草莓EMS突变体，具有植株矮小，叶片、花以及果实均变小的表型，命名为ros（reduced organ size）。回交F2群体混池重测序结果表明候选基因为RdDM途径重要调控元件FveFDM1，因此该突变体重命名为fvefdm1。该突变体叶片、花和果实细胞数目均显著低于野生型，说明细胞分裂受阻。通过基因编辑获得了几株fvefdm1CR突变体，与fvefdm1突变体表型相似，证明FveFDM1即为该突变体的致突变基因。在拟南芥fdm1-1 fdm2-1突变体中过表达FveFDM1能够回补该双突变体中RdDM靶位点AtSN1和IGN5的DNA甲基化水平，暗示FveFDM1在草莓中也参与了RdDM途径。FveFDM1与同源蛋白FveFDM2和FveIDN2发生蛋白互作，说明FveFDM1同样以蛋白复合体形式发挥功能。根据全基因组甲基化数据，fvefdm1突变体花原基中的CHH类型甲基化水平明显低于野生型，CHG类型降低程度较小，而CG类型甲基化水平变化不大。CG、CHG、CHH差异甲基化位点（DMRs）分别有4842、18662和74749个，且绝大多数为甲基化水平下降。相同组织的小RNA测序结果表明，fvefdm1突变体中24-nt小RNA的总体丰度没有变化，而DNA低甲基化区域的siRNA丰度显著下降。在WT和fvefdm1突变体的茎尖、花原基以及早期果实的RNA-seq结果中，162个基因在3个组织中均显著上调，“cell cycle”和“cytoskeleton”是富集程度最高的两个GO term。部分差异表达的重要基因具有组织特异性，如四个细胞分裂调控基因只在茎尖中显著下调，四个赤霉素合成基因只在果实中明显下降，两个赤霉素代谢基因明显升高。Chop-PCR结果显示这些基因启动子区域的DNA甲基化程度有明显差异。综上，本研究阐明了RdDM途径重要调控元件FveFDM1通过CHH甲基化调控草莓器官大小的分子机制，同时挖掘了可能调控器官大小的候选基因，为后续研究提供了数据支持。