碱性环境下高稳定性γ-谷氨酰转肽酶的分子设计与构建

γ-glutamyltranspeptidase (GGT) is a heterodimeric protein. It has been used in biosynthesis of several valuable γ-glutamyl compounds, which were widely used in the fields of medicine, food and cosmetics. Unfortunately, GGT suffered subunits dissociation under alkaline conditions, resulted in the decrease in its activity. In this project, a 3D structure of GGT from Bacillus subtilis NX-2 was constructed by homology modeling. By analyzing the composition, properties and positions of the residues in the interface between GGT subunits, the potential mutation sites were selected. In order to increasing the hydrophobic interaction between GGT subunits, the vested sites were replaced with nonpolar amino acid. The final mutation schemes were screened by simulating calculation of the folding structures and energy parameters for the mutant enzymes. Then, the mutant genes were synthesized and expressed in Escherichia coli. The effects of mutagenesis were evaluated according to the catalytic properties and stabilities for the mutant enzymes under alkaline conditions. Finally, the denaturation mechanisms for the native and mutant enzymes were investigated by the means of PAGE electrophoresis and spectroscopic methods.

γ-谷氨酰转肽酶（GGT）是一种异源二聚体蛋白，可用于催化合成许多重要的谷氨酰化合物。但GGT在碱性环境下极易发生亚基解聚，导致其不可逆失活，难以满足工业需求。本项目拟以B.subtilis NX-2 GGT为对象，在获得其结构基因的基础上，采用同源建模建立酶分子的3D结构模型；通过分析GGT大小亚基相互作用面的残基组成、性质及空间位置确定候选突变位点；以强化GGT亚基间疏水相互作用为目标，将候选位点替换为疏水性氨基酸，并通过模拟计算预测突变酶结构，优化突变方案；合成突变基因，并在E.coli中实现其高效表达；考察突变酶在碱性环境下的催化特性及稳定性，验证突变效果，筛选得到催化效率高、稳定性强的突变酶；同时，采用Native PAGE，结合FT-IR、CD光谱和荧光光谱等方法，分析天然酶和突变酶在变性过程中的构象变化，阐明其失活机制,为寡聚酶的稳定化改造和性能优化提供方法学上的借鉴。

γ-谷氨酰转肽酶（GGT）在自然界中分布广泛。不同来源的GGT均为异源二聚体蛋白，由大、小两个亚基组成。GGT可特异性催化γ-谷氨酰基的转移反应，在生物有机合成领域的应用广泛。为了抑制副反应，体外进行的GGT反应需在碱性条件（pH >8.5）下进行，而在该条件下GGT的pH耐受性差，极易发生亚基解聚，并引发不可逆的变性失活。.本项目以B．subtilis str.168 GGT的晶体结构为模板，构建了Bacillus subtilis NX-2（wt_GGT）的3D结构预测模型，并从该模型出发，按照距离GGT活性中心（403-T）距离>15Å、保守性<100%、排除疏水性氨基酸，以及距另一链链距离<2.6Å的标准，筛选得到6个候选突变位点。采用PCR介导的定点突变，将上述候选位点分别替换为缬氨酸，并成功实现了D46V、T201V、Y280V、Q322V、E502V和H543V等6个突变酶的异源表达。分别测定了6种突变酶的稳定性及催化特性，结果显示：大多数突变酶的特性（如Km、kcat和Ea）与wt_GGT 相近，但Y280V的kcat显著高于wt_GGT；D46V、Y280V和E502V的pH稳定性分别较wt_GGT提高了50.72%、58.33%和8.59%，同时上述3种突变酶的热稳定性也明显优于wt_GGT。Pymol软件分析显示，在<10Å距离内，V-46、V-502和V-280附近均存在一定数量的疏水性氨基酸，且分别位于A链和B链，可与突变残基间发生疏水相互作用，这有助于提高突变酶亚基间的相互作用能，其中V-280可与附近4个氨基酸（Y-283、W-277、I-501和I-497）的侧链产生疏水相互作用，形成的疏水力场更强。.同时，本项目还构建了三种双突变酶（D46V-Y280V、Y280V-E502V和D46V-E502V）。测试结果显示，突变酶的稳定性均较wt_GGT明显改善。在pH 11.0条件下，D46V-Y280V、D46V-E502V和Y280V-E502V的稳定性分别较wt_GGT提高了60.09%、90.64%和98.52%；同时，D46V-E502V和Y280V- E502V在55oC下的失活速率常数（kd,T）值也仅为wt_GGT的39.7%和17.8%，热稳定性明显改善。