脐形紫菜番茄红素环化酶的分子生物学研究

Carotenoids are essential pigments for photosynthesis and photoprotection in plants. In carotenoid metabolic pathway, lycopene is an important branching point. The linear molecule of lycopene can either be β-cyclized at both ends to produce β-carotene or be β- and ε-cyclized at each end to produce α-carotene. Higher plants have separate lycopene cyclases to catalyze β- and ε-cyclization reactions. However, carotenoid distribution in red algae shows great variation. In some red algal groups, no carotenoids with an ε-ring can be detected, suggesting an absence of the ε-cyclization branch in these organism. To decipher carotenoid metabolism in red algae, we propose to carry out our work with Porphyra umbilicalis, an intertidal red alga that shows great acclimation to the rhythmic extraordinary stresses of high irradiation, dehydration, etc. It was reported that P. umbilicalis uses either β-carotene from the β,β-cyclization branch, or lutein from the β,ε-cyclization branch, for its photoprotection. Our bioinformatic analysis suggests the presence of three lycopene cyclase genes in this alga. We are going to clone these genes, and to functionally characterize the enzymatic activities of their coding products. Together with the quantifications of different carotenoid constituents and of the expression of genes on carotenoid metabolic pathway in P. umbilicalis under various stressed conditions, we should be able to understand how P. umbilicalis uses its carotenoid metabolic pathway to cope with different environmental stresses. By comparing the sequences of the enzyme genes we cloned with other lycopene cyclase sequences from different organisms, we should also be able to find how lycopene cyclases with β- or ε-cyclization activities diverged from a single lycopene β-cyclase during the early evolution of plants.

番茄红素是类胡萝卜素合成途径的关键分支点，可在其分子两端进行β,β-环化形成β-胡萝卜素，或分别进行β-和ε-环化产生α-胡萝卜素。高等植物由不同的番茄红素环化酶分别催化β-和ε-环化。但在原始的红藻门，一些类群不含具有ε-环的类胡萝卜素。在本项目中我们将以脐形紫菜为材料，对其番茄红素环化酶进行研究。脐形紫菜生长于潮间带，适应高光、失水等极端胁迫，并可能通过来自β,β-环化分支的β-胡萝卜素或来自β,ε-环化分支的叶黄素进行光保护。我们推测其可能有三个基因编码这些环化酶，并将对这些基因进行克隆。通过对环化酶的功能鉴定，结合不同胁迫处理下类胡萝卜素成份及基因表达分析，将能够揭示紫菜通过类胡萝卜素途径对环境胁迫的响应机制。通过对所克隆基因的序列和功能分析，还将能了解类胡萝卜素代谢途径由单一环化酶催化β-环化向多个环化酶分别催化β-和ε-环化的进化过程，以及该过程对红藻适应环境胁胁迫的意义。

类胡萝卜素是重要的捕光和光保护色素。其合成途径在高等植物中已经得到较为详细的研究。番茄红素(lycopene)是类胡萝卜素代谢途径的第一个分支点。其可以经番茄红素β-环化酶(LCYB)催化分子两端β-环化产生β-胡萝卜素，并由之形成玉米黄质、花药黄质、堇菜黄质和脱落酸等；或由ε-环化酶(LCYE)与LCYB分别催化ε-和β-环化产生α-胡萝卜素，随后形成叶黄质。红藻是内共生所产生的最原始的光合真核生物。对其类胡萝卜素成分分析表明，最原始的单细胞红藻只含β-分支且只能合成到玉米黄质，但其较为高等的多细胞类群则含有β-和ε-两个分支的代谢途径，能合成花药黄质和叶黄质，显示出巨大的差异性。迄今为止对红藻的类胡萝卜素代谢研究还非常有限。红毛菜纲(Bangiophyceae)是能够合成叶黄质的最为原始的红藻类群，但此前只有红毛菜(Bangia fuscopurpurea)的LCYB被本实验室克隆鉴定，而其ε-环的起源尚不清楚。本课题对红毛菜纲脐形紫菜(P. umbilicalis)和条斑紫菜(P. yezoensis)的研究分别从2个物种中各克隆了2个番茄红素环化酶基因。利用大肠杆菌色素互补系统和拟南芥突变体进行的功能验证表明，这2个物种各含有1个LCYB和1个LCYE。对这2个迄今为止所知最为原始的LCYE的解析阐明了多细胞红藻中叶黄质生物合成途径的第一步反应。根据蛋白序列进行的进化分析显示，在第一次内共生前LCYB和LCYE可能已经发生了分化；LCYE在从绿藻到高等植物的绿色家系中功能保守；而LCYB则在多细胞红藻中独立分化为LCYE，且该分化发生在第二次内共生形成硅藻等物种之后。在研究中我们还发现红藻蛋白的叶绿体转运肽不能被高等植物识别。此外，我们在本课题的研究工作中还建立了一个新的基于蓝细菌的类胡萝卜素代谢酶活鉴定系统，该系统有助于解决大肠杆菌系统缺乏必要的辅因子和拟南芥系统存在基因冗余和类胡萝卜素成分复杂的技术问题，为今后的酶活鉴定提供了可靠性和便利性。我们进一步利用该系统在蓝细菌中搭建了ε-分支的叶黄质合成通路，并将其β-分支从玉米黄质拓展到堇菜黄质，展示了其作为合成生物学底盘的可能性。为了解决红藻基因组组装质量普遍较低，可能存在基因缺漏的问题，我们还建立了一个新的无gap基因组组装策略，并正在用于对相关物种的重测序和组装工作中。