Wip1对胚胎干细胞自我更新、分化与致瘤性的作用及其分子机制研究

"Stem cell therapy" has the potential to cure many human uncurable diseases. However, the tumorigenesis characterization of pluripotent stem cell must be resolved before the clinical application. An understanding of the role of Wip1 in self-renewal,differentiation and tumorigenesis of pluripotent embryonic stem cells (ESC) and their regulatory mechanism is critical as this could lead to resolving the problem of tumorigenesis in stem cells and dissecting the pathogenesis of cancers. Based on the latest report that Wip1 is a new type of oncogene and plays a positive role in the proliferation capacity of neural stem cells and mesenchymal stem cells. But the role of Wip1 in pluripotent stem cell and their regulatory mechanisms remain unkown. With the application of Wip1 knockout mice, we will establish the ESC lines of Wip1 knockout and wildtype; To explore the effect of Wip1 on self-renewal,neural differentiation and tumorigenesis in ESC; To decipher the molecular mechnisms of these regulatory effect and uncover the key regulators in the Wip1 regulatory network; To better the self-renewal or neural differentiation of ESC with small molecule agonists or antagonsits of these key regulators, which avoid the transformation of differentiating stem cells to cancerous stem cells as well as decrease the possibility of tumorigenesis after stem cells or their differentiated cells were transplantation into animal disease models,result in the successful clinical application of stem cells without tumorigenesis and the final therapy of the uncurable diseases.

干细胞治疗为目前一些难以医治的疑难疾病治疗带来希望，但在其临床应用之前，必须解决干细胞致瘤性的安全问题。Wipl是一个新型的原癌基因，对正常的生理功能也起着重要的调控作用，参与调控神经干细胞及骨髓干细胞的自我更新及分化，但对多潜能干细胞的作用及其调控机理并不清楚。本项目拟利用Wipl缺陷小鼠建立Wipl缺陷型及野生型多潜能胚胎干细胞系；研究Wipl对胚胎干细胞的自我更新、神经分化及致瘤性的作用，并探讨其调控的分子机制，揭示Wipl调控网络的关键分子；解析抑制或激活这些调控关键分子能否改善多潜能干细胞的自我更新及神经分化，能否避免分化过程中分化细胞转变为肿瘤细胞，并降低移植细胞在动物模型体内的致瘤性，从而使干细胞治疗成为可能。通过此研究，可为认识多潜能干细胞自我更新、分化及致瘤性的分子机理提供科学证据，对解决多潜能干细胞的致瘤性问题及理解肿瘤的发病机理具有重要的理论与临床实践意义。

干细胞治疗为目前一些难以医治的疑难疾病治疗带来希望，但在其临床应用之前，需要掌握干细胞增殖分化特征及其分子调控机制以及解决体内干细胞移植的致瘤性等安全性问题，才能稳定达到干细胞临床治疗的安全有效。本研究利用慢病毒转染、CRISPR/Cas9等技术对成系小鼠胚胎干细胞进行Wip1基因敲低、敲除及过表达改造，以及通过囊胚内细胞团建系方法用Wip1转基因小鼠建立Wip1野生型及敲除型胚胎干细胞系。用这两种实验方法，研究Wip1基因的敲除、敲低及过表达对胚胎干细胞增殖、分化及致瘤性的作用。然而，我们的研究结果发现Wip1对胚胎干细胞的增殖、分化及致瘤性的特征没有作用。筛选研究发现Shp2影响胚胎干细胞的增殖分化，Shp2的敲除降低了小鼠胚胎干细胞的增殖能力（即自我更新能力），并抑制小鼠胚胎干细胞的诱导分化进程，但Shp2的敲除并没有影响胚胎干细胞畸胎瘤的形成。前期研究结果显示Shp2调控Erk、Stat3及Smad信号通路而影响胚胎干细胞的增殖及分化，而我们的研究结果表明，Shp2影响小鼠胚胎干细胞的增殖及分化，除了通过Erk及Stat3等信号通路调控这一作用，Shp2能进入细胞核内，在细胞核内可能通过Wnt-β-Catenin/E-Cadherin信号网络及表观调控机制而影响胚胎干细胞的增殖及分化。同时，添加抑制BMP-Smad、TGF-β-Smad、Wnt、Notch或FGF等信号通路的化学小分子或化学小分子组合能有效诱导小鼠胚胎干细胞向神经干细胞及视网膜神经节细胞的定向分化，建立了成分限定的神经干细胞定向诱导分化体系。因此，Smad、Wnt、Notch及FGF信号通路参与调控小鼠胚胎干细胞的自我更新及神经分化。神经干细胞在胶质细胞定向分化体系内也能分化成星型胶质细胞及少突胶质细胞，神经干细胞移植入SD大鼠侧脑室内能成功迁移并分化成神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞，移植细胞并没有检测到肿瘤形成。通过此研究，可为认识多潜能干细胞自我更新、分化及其分子机理提供科学证据，对干细胞临床治疗的致瘤性等安全问题的解决具有重要的理论与临床指导意义。