光镊纳米孔力谱传感器及其单分子测序应用

Due to the natural advantages of low cost, fast speed, long read-length and single molecule resolution, nanopore sequencing is considered as the most promising 3rd generation sequencing method and is being developed rapidly in the most recent decade. Currently, a portable Minion sequencer (Oxford Nanopore Technologies) could sequence a viral genome (>250 kbp) in couple hours with less than $1000 cost. However, the bottle neck of low accuracy, low throughput and single modality is limiting the further development of the nanopore methodology in human genome sequencing. The microscopy based optical nanopore technology, which encodes invisible patch clamp signal into visible fluorescent spots blinkings, is boosting the throughput of nanopore sequencing to >10^5/mm^2. Besides that, many microscopy based single molecule methods could now be easily integrated into the optical nanopore platform for more information-rich investigations. This proposal illustrates a novel optical tweezers-nanopore instrument for simultaneous force spectroscopic and nanopore sequencing measurement aiming to improve the sequencing accuracy to more 99% while still maintaining the throughput high. The successful development of this sequencing method also brings autonomous intellectual property rights of 3rd generation sequencing method for our country.

以英国Oxford Nanopore公司的Minion便携式测序仪为代表的纳米孔测序技术现已经能够在几个小时时间内实现一个病毒基因组（>250 kbp）的测序，而仪器成本也控制在1000美金以下且方便携带。具备如此前景的纳米孔测序方法在本质上仍有诸多不足包括：检测通量低，检测模式单一以及测序正确率低等。最新的光学纳米孔检测阵列技术使得原本不可见的纳米孔电学测量转变成了明亮的荧光亮点信号，该技术不仅大大提高了检测通量（10^5/mm^2）并使得纳米孔测序和一系列光学单分子技术结合变为了可能。本申报课题拟原创性的采用单分子光镊技术与纳米孔结合，实现实时的纳米孔/力谱双轨测量，在保持高通量检测的优势下，增加一个力谱检测维度以提高测序正确率。该技术预期进一步突破纳米孔测序的正确率瓶颈，实现单分子测序正确率>99%，并跨越式开发出具有我国自主知识产权的第三代人类基因组测序技术。

纳米孔测序技术是近年来兴起的新型第三代测序技术的代表。基于纳米孔测序技术的病原体快速诊断、长片段基因组直接测序和太空测序等应用都被陆续报道并引起了广泛的社会关注。然而，现阶段纳米孔测序技术仍然存在包括测序准确率低，测序通量低等缺陷。本项目拟采用近年来被发展起来的基于钙离子荧光的纳米孔显微成像技术为基础，结合单分子光镊技术实现光镊-纳米孔双模态检测，预期实现由光镊汇报单分子酶动力学步进，由纳米孔汇报单分子碱基特征的双模式测序实现更加精准的纳米孔直接测序检测。在实际的项目开展中，为了匹配双模态运行，项目负责人首先完成了一种高度简化的无电极荧光纳米孔芯片阵列的制作。此外，项目负责人亦成功搭建了一套基于倒置荧光显微镜的单分子光镊系统，并可以完成纳米孔的操控。项目负责人亦自行开发了一套纳米孔测序装置，并可以稳定输出纳米孔测序数据，检测准确率达到了80%以上。其中，无电极纳米孔芯片技术除了在整合光镊-纳米孔双模态运行中具备潜在应用。该技术作为一种独立的纳米孔技术亦展示了首个无需电极的纳米孔直接检测且成本极为低廉，具备潜在的可抛弃式医学检测应用。我们所开发的纳米孔测序技术亦在包括非天然核酸、miRNA和碱基损伤等应用中报道了一系列首创性工作。在以上工作的基础上，光镊-纳米孔的双模态整合工作正在进行中，并将结合新近开发的共聚焦照明方式实现高速的纳米孔测序信号的荧光汇报，预期有望实现兼顾空间分辨率、检测成本和检测通量的新型纳米孔测序技术。