新型抗肝癌FGF21突变体的设计及作用机制研究

Primary liver cancers is a major disease and hazard to human health. Studies have shown that FGF21 binding its different receptors (FGFR1 and FGFR4) exhibited different effects. FGF21 binding FGFR1 could promote liver cancer process in the early formation of liver cancer. On the contrary, FGF21 binding FGFR4 could inhibit the occurrence and process of liver cancer. In addition, studies found that FGFR4 expression in hepatoma cells was significantly enhanced and may be a drug target to the treatment of liver cancer. Therefore, we designed 20 kinds of FGF21 mutant on the basis of "FGF21 mutant with high affinity of FGFR4, low affinity of FGFR1, thereby inhibiting development of liver cancer". This study will use computational biology, yeast two-hybrid, luciferase activity analysis, Co-IP and poll-down to design and select FGF21 mutants with high affinity of FGFR4. And further explore cell proliferation, cell cycle, apoptosis and other aspects of the MAPK signaling pathway-related gene expression changes to clarify the mechanisms of FGF21 mutant inhibition of liver cancer development and to provide new ideas and new targets for the treatment of liver cancer.

原发性肝癌是严重危害人类健康的重大疾病，已有研究表明，在肝癌形成早期，成纤维细胞生长因子-21（FGF21）与受体1（FGFR1）结合，能促进肝癌发生发展；而其与受体4（FGFR4）结合，能抑制肝癌发生发展。我们研究证实FGF21与FGFR1和FGFR4均能结合，并发现FGFR4在肝癌细胞中表达显著增强，很有可能是肝癌治疗的新药靶。因此我们在前期设计20种FGF21突变体基础上提出"获得与FGFR4高亲和力、与FGFR1低亲和力的FGF21突变体；启动FGF21/FGFR4信号，拮抗FGF21/FGFR1效应，从而抑制肝癌发生发展"的假说。本研究运用计算生物学、酵母双杂交、荧光素酶活性分析、免疫共沉淀、体外结合等实验，设计构建与FGFR4高亲和性、特异的FGF21突变体。研究MAPK信号通路相关基因表达调控变化，阐明FGF21突变体抑制肝癌发生发展分子机制，为肝癌治疗提供新思路和新靶点。

原发性肝癌是严重危害人类健康的重大疾病，已有研究表明，在肝癌形成早期，成纤维细胞生长因子-21（FGF21）与受体1（FGFR1）结合，能促进肝癌发生发展；而与受体4（FGFR4）结合，能抑制肝癌发生发展。我们研究证实FGF21与FGFR1和FGFR4均能结合，并发现FGFR4在肝癌细胞中表达显著增强，很有可能是肝癌治疗的新药靶。因此我们在前期设计20种FGF21突变体基础上提出“获得与FGFR4高亲和力、与FGFR1低亲和力的FGF21突变体；启动FGF21/ FGFR4信号，拮抗 FGF21/ FGFR1效应，从而抑制肝癌发生发展”的假说。本研究运用计算生物学、酵母双杂交、荧光素酶活性分析、免疫共沉淀、体外结合等实验，设计构建FGFR4高亲和性、特异的FGF21突变体。围绕上述研究我们取得了如下结果：表达和纯化三种FGF21突变体蛋白（FGF21A59C、FGF21G71C、FGF21A59C, G71C）；体外实验表明，FGF21G71C 突变体稳定性明显高于FGF21A59C 和FGF21A59C, G71C；建立FGF21突变体蛋白质固相PEG化学修饰用；修饰后的FGF21突变体蛋白稳定性增强，体内半衰期延长；获得FGFR4K及其突变体FGFR4K V550L的晶体结构；FGF21可以抵抗氧化应激引起的细胞损伤，并改善体内动脉粥样硬化，通过MAPK途径保护氧化应激诱导的细胞凋亡；FGF21有效降低动脉粥样硬化大鼠血清中总胆固醇、低密度脂蛋白水平，同时升高高密度脂蛋白水平；成功构建表达人FGFR1和FGFR4胞外区的基因工程菌，并获得了很好的表达；优化了pET20b-SUMO-FGF21[L59R]基因工程菌的发酵表达条件。这些数据为FGF21及其突变体在糖尿病和动脉粥样硬化以及肝癌的治疗提供新思路和新靶点。