细胞自噬导致气道炎症损伤在RSV感染哮喘中的作用机制及清肺口服液的调节作用

Autophagy plays an important role in asthma of children’s airway inflammation injury with Respiratory Syncytial Rirus (RSV) infection,PI3K/Akt/ mTOR signaling pathway is a key signal pathway regulator of cell autophagy. Previous studies has found that Qingfei Oral Liquid can decrease LC3-Ⅱprotein expression of autophagy and Atg5 expression of asthma-related-autophagy molecules in human’s airway epithelial cell with RSV infection, which can reduced expression of inflammatory cytokines, suggesting Qingfei oral liquid can mitigated airway inflammation by inhibiting autophagy. Thus, the project intends to build RSV infection airway modelin vivo and vitro, we plan to observe that Qingfei Oral Liquid can reduce autophagosome of lung in mice by using electron microscopy and immunohistochemistry, lung function was observed by Buxco RC in mice. The effect of Qingfei Oral Liquid on the expression of airway inflammation cytokines and key signaling molecule by RT-PCR and Western blot. On the cellular level, we will research changes of cell macrophage morphology and the expression of PI3K, Akt, mTOR, LC3-Ⅱ, baclin-1 protein, by confocal laser,gene cloning, signaling pathways blocking, co-immunoprecipitation etc. Through analysis the datas, we probes into the mechanism of intervention RSV infection in asthma of children’s airway infection injury with Qingfei Oral Liquid. And provide a theoretical basis for preventing and/or treatment airway inflammation of asthma of children who were infected with RSV in Traditional Chinese Medicine.

细胞自噬在RSV感染哮喘气道炎症损伤中发挥重要作用，PI3K/Akt/mTOR是细胞自噬调控的关键信号通路。前期研究发现清肺口服液可以下调RSV感染呼吸道上皮细胞自噬关键分子LC3-Ⅱ及哮喘相关自噬分子Atg5蛋白的表达，从而下调炎症因子表达，提示清肺口服液可以抑制细胞自噬而减轻气道炎症。鉴此，本项目拟构建体内外RSV感染气道损伤模型，使用电镜、免疫组化、小鼠肺功能仪、RT-PCR、Western blot方法观察清肺口服液对体内模型细胞自噬定位表达、肺功能、气道炎症因子及关键信号分子的影响；使用激光共聚焦、基因克隆、信号通路阻滞、免疫共沉淀技术，研究清肺口服液通过PI3K/Akt/mTOR通路调控呼吸道上皮细胞自噬而减轻气道炎症，揭示清肺口服液调节RSV感染哮喘后气道炎症损伤修复作用的机制。为中医药治疗RSV感染哮喘儿童提供理论依据和新的治疗策略。

本课题组前期研究表明，清肺口服液（QF）可减轻呼吸道合胞病毒（RSV）感染哮喘小鼠气道炎症及降低哮喘小鼠气道高反应性。在本次研究中，我们采用质谱鉴定了QF主要成分。我们成功用Hep-2孵育RSV病毒，并构建RSV感染哮喘小鼠模型。我们通过组织病理（HE、PAS、VG染色）发现QF可减轻RSV感染的哮喘小鼠肺组织的气道炎症；QF可减轻模型小鼠气道阻力，提高小鼠的气道顺应性，从而改善肺功能；ELISA检测结果表明QF可以降低小鼠血清IgE的表达；降低TNF-α、IL-4、IL-6和IL-13表达水平，可以提高IFN-γ的表达水平。电镜和激光共聚焦技术评估RSV感染的哮喘小鼠肺组织自噬体的形成和LC3B蛋白的表达。动物组织WB结果表明QF可能具有激活mTOR信号通路而降低自噬相关蛋白LC3B、LC3A、Beclin1和Atg5的表达水平同时提高P62蛋白表达水平。动物实验发现QF具有抑制P-PI3K、P-AKT蛋白表达，提高P-AMPK、P-TSC1/TSC2蛋白表达的作用；细胞实验：构建RSV感染呼吸道上皮细胞（16HBE）细胞模型，使用mTOR的抑制剂雷帕霉素（Rampin）诱导自噬发生，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)，证实QF可以激活mTOR通路的表达而抑制自噬的发生。为了验证mTOR通路上游信号通路，课题组使用阻滞剂,抑制PI3K观察PI3K-AKT-mTOR，AMPK-TSC1/TSC2-mTOR信号通路的关键信号分子的表达，但在细胞实验中，暂时未证明通过上述通路起作用，我们下一步优化实验条件重复实验，进一步验证信号通路的干预作用。最后，我们采用了分子对接技术模拟了QF的具体成分作用于自噬的关键分子，经过分子模拟我们确定了mTOR、LC3B和Atg5与丹参酮螺内酯，桑辛素D和丹参酮的活性成分具有结合位点。这些发现表明，QF可以减轻RSV感染哮喘小鼠引起的气道炎症，其机制可能与mTOR信号通路参与自噬的调节机制相关。本研究尚未完全阐明QF抑制RSV感染哮喘调节的作用机制，课题组将继续进行探究。