视紫红质胞内转运的机制研究

Rhodopsin is one of components involved in phototransduction in photoreceptors. It is not only important for retinal function, but also plays a key role in regulation of development of photoreceptor outer segments. Rhodopsin is synthesized in photoreceptor inner segments followed by delivery to outer segments through the mechanism of intracellular protein transport. Trafficking rhodopsin to outer segments depends on the targeting signal located at the C-terminus of rhodopsin. Mutation of the C-terminal sequence of rhodopsin leads to retinitis pigmentosa. The in vitro assays indicated that a light chain of dynein, Tctex-1, could interact with the C-terminus of rhodopsin. Tctex-1 containing dynein could mediate movement of rhodopsin-bearing vesicles along microtubule. Additionally, LC8, another light chain of dynein could be also invovled in intracelluar transport of rhodopsin and other membrane proteins. This proposal is aimed to dissect the in vivo role of Tctex-1 and LC8 in regulation of rhodopsin and other membranes proteins by generating rod photoreceptor-specific knockout mice， by which we can elucidate the mechanism of inivo intercellular transport of rhodopsin. Meanwhile, we attempt to search additional proteins which can interact with the C-terminus of rhodopsin by biochemical approaches, further getting inside into intracellular transport process of rhodopsin. Thereby, we may discover new genes for retinal degeneration.

视紫红质是视杆细胞光信号转导通路中的一个重要蛋白，它不仅对视网膜的功能至关重要，对于视杆细胞外节的形成也起重要的调节作用。视紫红质在视杆细胞的内节合成后，通过胞内蛋白转运机制被运送到外节。视紫红质运输到外节依赖于其C末端的定位序列，视紫红质的C末端序列序列发生突变会导致视网膜色素变性。在体外，动力蛋白Dynein的一条轻链Tctex-1可与紫红质的C末端相互作用，介导视动力蛋白驱动带视紫红质的膜泡沿着微管移动。另外，动力蛋白的另一个轻链LC8也可能参与视紫红质的在感光细胞内的运输。本项目旨在通过构建Tctex-1和LC8的视杆细胞特异的条件敲除小鼠模型，研究Tctex-1和LC8在内体调节视紫红以及其他膜蛋白转运的机制，阐明体内视紫红质的胞内转运机制；并通过生化等其他手段，寻找与视紫红质C末端相互作用的蛋白，进一步深入了解视紫红质胞内转运过程，同时可能发现新的视网膜致病基因。

视紫红质是视杆细胞光信号转导通路中的一个重要蛋白，它不仅对视网膜的功能至关重要.，对于视杆细胞外节的形成也起重要的调节作用。视紫红质在视杆细胞的内节合成后，通过胞内蛋白转运机制被运送到外节。视紫红质运输到外节依赖于其C末端的定位序列，视紫红质的C末端序列发生突变会导致视网膜色素变性。在体外，动力蛋白Dynein的一条轻链Tctex-1可与紫红质的C末端相互作用，介导视动力蛋白驱动带视紫红质的膜泡沿着微管移动。但另外，动力蛋白的另一个轻链LC8也可能参与视紫红质的在感光细胞内的运输。也有证据表明LC8蛋白还和ARL3蛋白相互作用，ARL3对纤毛发生以及感光细胞外节的发育必不可少。目前关于Tctex-1和LC8在感光细胞中功能只停留在体外研究，关于它们在体内如何感光细胞的功能还未知。本项目的初始计划是构建视网膜特异的Tctex-1基因敲除小鼠，但由于小鼠的Tctex-1基因存在基因扩增的情况，而在大鼠中的Tectex-1基因不存在基因扩增的情况。为此我们转而用另一个较常用模式动物大鼠并成功地构建了Tectex-1基因敲除大鼠。对敲除大鼠的表型分析表明，Tctex-1缺陷会导致感光细胞内蛋白运输异常，表明Tctex-1参与调控感光细胞内蛋白的运输。同时，我们按计划构建了LC8基因的敲除小鼠。LC8基因被敲除后，小鼠的感光细胞功能基本不受影响，感光细胞内蛋白的运输也是正常，但小鼠长到18个月时感光细胞会发生缓慢的变性。表明LC8对感光细胞内蛋白运输所必需，但其对感光细胞功能具有微调作用。 为进一步研究LC8的功能，我们在培养的IMCD3细胞过表达LC8和LC8-2基因，发现这两个基因的过表达都使纤毛的变短。在小鼠中敲低LC8-2基因则使视锥细胞的视蛋白运输异常，表明LC8-2对视锥细胞内蛋白运输具有调节作用。本项目的完成加深了我们对Tctex-1和LC8基因在感光细胞内功能的认识。在本项目的实施过程中，共发表了7篇SCI论文，另有2篇的SCI论文在同行评议中。 此外，还申请了4个发明专利。