珍稀濒危兰科植物种子超低温保存的蛋白质组学研究——以五唇兰为例

The long-term preservation of germplasm resources of endangered orchid plants, is the base of species conservation, rescue and restore, and being important for conservation studies of plant germplasm resources. Seeds are idea materials for long-term conservation of germplasm resources. However, seeds of orchids appear to be short-lived and can’t be storaged in seed bank for longtime. Cryopreservation is an ideal method for the long-term conservation of orchid germplasm. But the molecular mechanisms of response to desiccation and cryopreservation in orchid seeds are still unclear, and the technique for the cryopreservation system is not optimized enough. In this research project, in order to investigate the mechanisms of response to desiccation and cryopreservation, seeds of Doritis pulcherrima (Orchidaceae), mainly distributed in Hainan Province, are used as the experimental materials, according the ultra-structural observation of seeds, determination of the changes of the relative electric conductivity, the activity of antioxidant enzymes, the contents of lipid peroxide and soluble sugars during the process of seed development, and analyzing the changes of protein expression profiles by applying the proteomics technique (iTRAQ-LC-MS/MS). The results of this study will provide new insight into better understanding the mechanisms of cryopreservation for orchid seeds, and establish more efficient system of cryopreservation. This project will provide theoretical basis and technique support for the germplasm conservation and utilization of the other rare and endangered orchid species.

濒危兰科植物种质资源的长期保存，是珍稀濒危植物物种保护和抢救性恢复的基础，是植物资源保护研究的重要问题。种子是兰科植物种质资源长期保存的理想材料，但兰科植物种子的寿命普遍较短，大多数兰科植物种子无法在种子库条件下长期保存。超低温保存是一种长期保存兰科植物种子的理想方法，但对超低温环境下种子脱水耐性和超低温耐性的分子响应机制尚不明确，超低温保存的体系也不够优化。本项目以分布在中国海南的五唇兰种子为研究对象，通过对种子发育过程中细胞组织结构的观察，相对电导率、抗氧化酶活性、脂质过氧化产物含量和保护性寡糖含量的测定，以及利用iTRAQ联合LC-MS/MS的蛋白质组学分析技术，对其脱水耐性和超低温耐性的响应机制进行研究；以期深入理解兰科种子超低温保存的分子机制，建立高效的超低温保存技术体系，为其他珍稀濒危兰科植物的种质资源保存与利用提供理论和技术基础。

濒危兰科植物种质资源的长期保存，是珍稀濒危植物物种保护和抢救性恢复的基础，是植物资源保护研究的重要问题。种子是兰科植物种质资源长期保存的理想材料，但兰科植物种子的寿命普遍较短，大多数兰科植物种子无法在种子库条件下长期保存。超低温保存是一种长期保存兰科植物种子的理想方法，但对超低温环境下种子脱水耐性和超低温耐性的分子响应机制尚不明确，超低温保存的体系也不够优化。本项目以分布在中国海南的五唇兰种子为研究对象，通过对种子发育过程中抗氧化酶活性、脂质过氧化产物含量和保护性寡糖含量的测定，以及利用TMT联合LC-MS/MS的蛋白质组学分析技术，对其脱水耐性和超低温耐性的响应机制进行研究。结果显示:(1)五唇兰种子具有一定的脱水耐性和超低温耐性；(2)高效的超低温保存技术为将种子脱水至含水量为10%-20%，然后进行超低温保存；(3)由于SOD、POD、DHAR、GR和可溶性蛋白的增加，五唇兰种子才具有脱水耐性和超低温耐性；(4)利用TMT定量蛋白质组学方法和生物信息学分析显示，在变化倍数≥1.2、p<0.05的标准下，共鉴定到4276个蛋白质，GO功能发现这些差异表达蛋白质的功能主要是分子功能分类中的结合和催化活性、转运蛋白活性、结构分子活性和抗氧化活性，主要参与了生物过程中的代谢过程、细胞过程、细胞组分组织或合成、定位和生物调节等重要生物学过程。KEGG通路富集分析发现，差异蛋白质主要富集在抗坏血酸和醛酸盐代谢、程序性坏死、溶酶体、过氧化物酶体、苯丙素的生物合成、碳同化、叶酸-碳库通路、氮代谢、酪氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、柠檬酸循环、糖酵解作用、嘌呤代谢等的代谢途径中。本项目研究深入理解兰科种子超低温保存的分子机制，建立高效的超低温保存技术体系，为其他珍稀濒危兰科植物的种质资源保存与利用提供理论和技术基础。