食管癌细胞核中微丝结合捆绑蛋白Fascin的功能及其分子作用机制研究

We have previously studied that an F-actin bundling protein Fascin localized in cytoplasm and was abnormally highly expressed in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) to promote tumor progression. In recent years, using immunofluorescence assay we have found that Fascin also localized in nucleus, which was then confirmed by immuno-blotting assay after isolation of cytoplasmic and nuclear proteins from several ESCC cells. However, the function of nuclear-localized Fascin is still unknown. Further studies showed that fascin was localized at the ion radiation-induced foci (IRIF) after ion radiation treatment, and several DNA damage repair-related proteins were identified when immunoprecipitated Fascin for mass spectrum analysis, which suggested that nuclear localized Fascin may participate in DNA damage repair. However, many further important scientific issues, like how Fascin interacts with DNA damage repair proteins, such as the specific interaction position between them, and how Fascin coordinates with DNA damage repair proteins in DNA damage repair pathway, that is the molecular mechanism by which Fascin cooperates with DNA damage repair proteins, still need to be studied. Therefore, in this project we will explore answers to the above questions at molecular level and ultimately elucidate the molecular mechanism mediated by nuclear-localized Fascin in DNA damage repair pathway.

我们以往曾研究发现，食管癌中位于胞浆的捆绑细胞微丝F-actin的蛋白Fascin异常高表达，发挥促癌功能。近年，我们通过免疫荧光观察发现，食管癌细胞中，Fascin还存在于胞核；此后我们分提核蛋白，通过免疫印迹确证Fascin的确存在于食管癌细胞的胞核，但其在食管癌细胞核中的功能尚不清楚。最近，我们进一步实验发现，在食管癌细胞的胞核中，Fascin与DNA损伤修复功能蛋白，不但共定位，而且还可能相互作用，暗示着在食管癌细胞的胞核中，Fascin可能参与DNA损伤修复，然而，Fascin与DNA损伤修复功能蛋白，究竟如何相互作用，即二者之间的精细相互作用情况，以及彼此间究竟如何协作，共同参与DNA损伤修复，亦即分子作用机制等更深层次的重要的科学问题尚有待于研究探讨。为此，本项目拟深入到分子水平，系统研究上述重要科学问题，深刻揭示食管癌中Fascin在胞核参与DNA损伤修复的分子作用机制。

我们以往研究发现，食管癌中位于胞浆的捆绑细胞微丝F-actin的蛋白Fascin异常高表达，发挥促癌功能，近年来我们研究发现Fascin还存在于细胞核中，但其在细胞核中的功能尚不清楚。本项目以探索Fascin蛋白在细胞核中的功能和机制为研究目标，获得如下发现：1）细胞核Fascin促进食管癌细胞对电离辐射的抵抗。构建利用Crisp/Cas9系统敲除Fascin的食管癌细胞模型，及回复Fascin特异细胞核定位和细胞质定位的食管癌细胞模型；特异性Fascin细胞核定位及细胞质定位过表达食管癌细胞模型；siRNA敲降及四环素诱导shRNA敲降Fascin食管癌细胞模型。利用上述细胞模型，在梯度剂量电离辐射处理条件下，统计其克隆形成数量，用单击多靶模型绘制细胞存活曲线，结果表Fascin敲除/敲降后细胞对电离辐射更敏感，而回复或过表达细胞核Fascin促进食管癌细胞对电离辐射的抵抗，表明Fascin参与DNA损伤修复过程。2）Fascin促进DNA损伤同源重组修复。利用胸腺嘧啶核苷进行细胞周期同步化，构建特异性G1期和G2期食管癌细胞电离辐射模型，检测在电离辐射情况后梯度时间条件下，DNA损伤标记γH2A形成的Foci数量变化情况，发现Fascin敲除后对G1期γH2AX形成Foci数量无影响，但是G2期γH2AX形成Foci数量有明显增加，表明Fascin未参与非同源末端链接修复途径，而是参与同源重组修复途径；此外，构建DNA双链断裂同源重组修复和非同源末端连接修复食管癌细胞报告系统，敲降Fascin后同源重组修复途径明显受到抑制，表明Fascin促进同源重组修复途径。3）Fascin与PARP1相互作用，促进ATM磷酸化。电离辐射情况下，Fascin敲除/敲降后同源重组修复途径关键激酶ATM-Ser1981位点的磷酸化水平明显降低；进一步研究发现Fascin与PARP1相互作用，体外Fascin被PRAP1进行PARylation修饰，同时Fascin促进PARP1的自我PARylation修饰。.综上所述，我们的研究初步探明了在食管癌细胞核中Fascin参与DNA损伤同源重组修复途径的功能和作用机制，为将Fascin转化开发为食管癌放疗敏感性标志物提供了重要基础研究数据。