新型ThDP类似物作为双靶标抑制剂类杀菌剂的合理设计、合成与化学生物学研究

Dual-target microbicides, acting on two different targets of pathogens simultaneously, are supposed to have better bioactivity and a low level of resistance risk. Currently, there are no microbicides targeting pyruvate dehydrogenase complex E1 (PDHc-E1) and acetohydroxyacid synthase (AHAS). PDHc-E1 and AHAS, two important rate-limiting enzymes in the metabolic process of microorganisms, are selected as the dual-target in this project. Thiamine diphosphate (ThDP) is a coenzyme required for both enzymes in their catalytic processes. Therefore, ThDP is first proposed by this study as a lead structure that can be optimized to obtain highly selective dual-target inhibitors.. According to the differences of ThDP binding modes with Escherichia coli (E. coli) PDHc-E1 and human PDHc-E1, and the similarities of ThDP binding modes with E. coli PDHc-E1 and Saccharomyces cerevisiae (Sc) AHAS, new series of ThDP analogs will be reasonably designed and efficient synthesis methods will be established. In this study, all the title compounds will be evalutated for their microbicidal activities. The highly active compounds will be further tested for their inhibitory activity against E. coli PDHc-E1, procine PDHc-E1 and ScAHAS to obtain highly efficient and highly selective dual-target inhibitors. Meanwhile, the binding modes between the protein and the inhibitors will be studied by molecular docking, site-directed mutagenesis, and inhibition kinetic analysis, which will provide important avenues and new insights into the development of microbicides with dual-targets and low resistance risk.

由于双靶标杀菌剂同时作用于病原菌的两个不同靶标，有利于形成协同增效和克服抗性。鉴于目前尚无以丙酮酸脱氢酶E1（PDHc-E1）和乙酰乳酸合成酶（AHAS）为靶标的杀菌剂的应用，本项目同时选择生物体内代谢过程中的重要限速酶——PDHc-E1和AHAS为靶标，以其催化过程中所依赖的共同辅酶焦磷酸硫胺素（ThDP）作为先导结构，首次提出设计合成高选择性双靶标抑制剂类杀菌剂的新思路。根据ThDP与大肠杆菌和人体PDHc-E1结合模式的差异性，同时结合ThDP与大肠杆菌PDHc-E1和酵母菌AHAS结合模式的相似性合理设计新型ThDP类似物，并建立高效合成方法。系统测试化合物的杀菌活性，在此基础上，测试高活性化合物对靶酶的抑制活性，筛选获得高效、高选择性双靶标抑制剂。并明确与抑制活性相关的关键作用位点，建立抑制剂-配体相互作用模型，为双靶标、低抗性杀菌剂的创制和开发提供思路和奠定基础。

由于双靶标抑制剂可以同时作用于植物病原菌的两个不同靶标，有利于形成协同增效和克服抗性。鉴于目前尚无以丙酮酸脱氢酶E1（PDHc-E1）和乙酰乳酸合成酶（AHAS）为靶标的杀菌剂的应用，本项目同时选择生物体内代谢过程中的重要限速酶----PDHc-E1和AHAS为靶标，首次提出设计合成高效、高选择性双靶标抑制剂的新思路。根据ThDP与大肠杆菌和人体PDHc-E1结合模式的差异性，同时结合ThDP与大肠杆菌PDHc-E1和酵母菌AHAS结合模式的相似性，通过改造ThDP的结构，设计了4大类新型ThDP衍生物，建立了10个系列目标化合物的合成方法。采用计算机分子模拟技术的预测体系指导分子设计, 合成了120个未见文献报道的新型目标化合物，完成了结构表征。.通过构效关系总结、结构优化合成、生物活性验证的多次循环，发现了潜在的双靶标抑制剂IIA，IVA和IVB。IIA系列中多个化合物对桃褐腐病菌的活体防效与戊唑醇相当，高于百菌清和克菌丹。IVA和IVB系列中多个化合物对水华蓝藻细菌具有显著的抑制活性，高于对照药扑草净，与常用杀藻剂硫酸铜相当。本项目采用分子对接、定点突变、酶学分析、实时荧光定量PCR相结合的方法，探明了抑制剂在E. coli PDHc-E1，porcine PDHc-E1和ScAHAS活性空腔中的作用模式。从作用方式上揭示了抑制剂具有高效性和选择性的原因，证实了设计思路的合理性。在本研究中，还意外发现具有高效杀藻活性化合物IIB作用于蓝藻光合作用系统。此外，本项目还获得了多个只作用于PDHc-E1的化合物（如IA和IIC），它们的杀菌活性高于克菌丹、百菌清、噻菌铜或叶枯唑。研究结果达到了预期的研究目标。.本项目采用简单高效的方法合成了多个具有潜在应用价值的ThDP衍生物，克服了文献报道的多种ThDP衍生物存在结构复杂、合成步骤多、选择性差、不具有应用价值的问题。对于创制和开发高效、安全的双靶标杀菌剂奠定了重要的研究基础。