蓝藻铜绿菌素Choi基团生物合成途径解析

Cyanobacteria are prolific producers of peptide toxins, the unique physiological properties of these peptide toxins are commonly contributed by their nonproteinogenic amino acid residues, such as Choi, which is the core residue of aeruginosin. AerD, AerE and AerF have been demonstrated to be responsible to Choi biosynthesis. AerD has been illustrated to be an enzyme catalyzing non-aromatizing decarboxylation of prephenate, which was considered to catalyze the first step involving the pathway from prephenate to Choi, while the exact roles of AerE and AerF in Choi biosynthesis remain to be elucidated. This study is aim to identify the catalytic properties and substrate specificities of AerE and AerF, propose the stepwise Choi biosynthesis pathway, and analyze the catalytic mechanism of these three enzymes participating in Choi biosynthesis. The results of this study will facilitate the exploring to the biosynthesis pathways of nonproteinogenic amino acids broadly existing at peptide toxins, and make the preparation for high-efficient heterologous expression of these physiologically active secondary metabolites and their derivatives in the future.

蓝藻拥有种类繁多的肽类毒素，这些肽类毒素的独特生理活性常由其中的非蛋白质氨基酸残基贡献，如铜绿菌素的核心基团Choi。蓝藻中共有的三个与Choi基团合成相关的蛋白：AerD、AerE和AerF已被发现。其中AerD 蛋白已被证实具有预苯酸脱羧酶的活性，被认为作用于由预苯酸至Choi 基团的合成代谢途径的第一步，而AerE和AerF蛋白作用于Choi基团合成途径的步骤尚未得知。本项目拟确定铜绿微囊藻AerE和AerF各自的催化属性和底物特异性，在此基础上提出组成Choi基团合成代谢途径的酶促步骤及其次序，并通过结构结构生物学和酶学手段解析这三种参与Choi基团生物合成的酶的催化机制。从而为深入探索广泛存在于肽类毒素中的非蛋白质氨基酸的以预苯酸为前体的的生物合成途径打开突破口，并为将来对这些具有独特生理活性的次生代谢物及其衍生物的异源高效表达奠定基础。

铜绿菌素（Aeruginosin）是一类普遍存在于蓝藻中的线形四肽毒素，为丝氨酸蛋白酶的强抑制剂，其抑制效率主要由其中的Choi基团决定。Choi基团的合成途径有待研究。本课题组通过原核重组表达获得来源于铜绿微囊藻的参与Choi基团合成代谢的三个酶AerD、AerE和AerF，采用经典酶学技术确定AerE和AerF各自的催化属性，在此基础上提出组成Choi基团合成代谢途径的初始步骤及其次序，并利用结构生物学和酶学手段解析这些Choi基团合成酶的催化机制。收集了AerD晶体1.8 Å分辨率的衍射数据，测定了AerD的催化动力学参数；鉴定了AerE的催化属性及其在Choi基团合成代谢中的作用步骤，解析了AerE及其与底物类似物的复合物的晶体结构，通过底物类似物结合位点分析配合突变体酶活验证确定了几个催化关键残基并推断了催化机制；鉴定了AerF的催化属性及其在Choi基团合成代谢中的作用步骤，解析了AerF及其与辅酶NADPH以及底物类似物的复合物的晶体结构，通过分析复合物结构中底物类似物和NADPH在活性口袋中的结合位点配合突变体酶活验证确定了两个关键丝氨酸分别参与质子传递起始和底物结合。本项目为深入探索广泛存在于肽类毒素中的非蛋白质氨基酸的以预苯酸为前体的的生物合成途径打开了突破口，并为将来对这些具有独特生理活性的次生代谢物及其衍生物的分子仿生合成和酶促改造奠定基础。