石斑鱼TLR9和TLR21信号通路及其抗病机制研究

TLR9 and TLR21 are two important members of toll-like receptor family, and both of which recognize unmethyl-CpG ODN oligodeoxynucleotide in higher vertebrates. However, TLR9 is absent in chickens and TLR21 is absent in mammals. Interestingly, TLR9 and TLR21 both have been identified in teloest species, which provides an opportunity for comparison study the functions of both receptors. In this study, we will study the functions of TLR9 and TLR21 identified from orange-spotted grouper. Concrete operations are as follows: 1. To study the sub-cellular localization, expressing-cells type and tissues localization of both receptors; 2. To determine the ligands recognized by TLR9 and TLR21, the structure sites connecting the ligands, and the adaptor and signaling transduction molecules; 3. To detect the cytokines regulated by each TLR; 4. To determine the expression profiles of the signal transduction molecules and cytokines triggered by TLR9 and TLR21 post infection with different type of pathogens. Above all, the results of this project will have great significance for us to trace back to the evolution of vertebrates TLR, understand of disease resistance mechanisms in fish and the development of new adjuvants and/or more effective vaccines and therapeutics against disease in aquaculture.

Toll样受体(TLRs)是一类重要的模式识别受体，在抗病原感染过程中发挥重要作用，TLR9和TLR21是该家族的重要成员，高等脊椎动物此二受体均能识别病原非甲基化的CpG-ODN。哺乳类只具有TLR9，而鸟类仅拥有TLR21；然而，鱼类则拥有TLR9和TLR21两种受体，此特性对我们在同一动物中同时比较分析两种受体的功能及其相互关系极为方便。本研究以石斑鱼TLR9和TLR21为对象，研究其亚细胞定位、表达细胞类型及组织分布，阐明受体行使功能的组织学基础；通过研究受体识别的配体及配体结合位点，分析其使用的接头蛋白及信号转导分子，揭示共存于鱼类的TLR9/21的功能和信号转导机制；通过研究TLR9/21信号途径诱导的免疫因子类型和病原感染对相关基因表达的调节作用，阐明其抵抗病原感染的分子机制。此研究结果对揭示脊椎动物TLR功能的进化起源、了解鱼类抗病机制以及研究疾病防控措施都具有重要意义。

高等脊椎动物TLR9和TLR21均能识别病原非甲基化CpG-ODN，但此二受体非共存于同一物种，然而鱼类同时存在TLR9和TLR21。基于此，本项目研究发现，共存于鱼类的TLR9和TLR21也都能识别非甲基化的CpG-ODN。获得了石斑鱼Tollip、IRAK-4、IRAK-1、TAK-1和TRAF6和等5个信号通路关键分子的序列，结构分析表明石斑鱼和其它鱼类这5个分子都具有哺乳动物同源蛋白的重要功能结构域，且大部分功能位点也是保守的。多序列比对和进化分析显示，石斑鱼与其它鱼类同源蛋白的相似度较其它脊椎动物高，且在进化树上鱼类同源蛋白聚为一支。定量检测了IRAK-4、IRAK-1、TAK-1和TRAF6在健康石斑鱼以及刺激隐核虫感染后不同组织中的表达情况，发现这4个基因在所检测的组织中均有表达，但表达模式存在差异，且寄生虫感染能调节其表达量。过表达石斑鱼MyD88、IRAK-1和TRAF6能激活NF-κB，而IRAK-4、TAK-1和Tollip对其活性无显著影响；然而，IRAK-4、TAK-1和Tollip却能抑制MyD88诱导的NF-κB活性，其中IRAK-4和TAK-1的负调控作用为鱼类特有；以上基因重要功能结构域或位点的缺失(突变)能在不同程度上抑制其对NF-κB活性调节作用。此外，以上6个蛋白都定位在细胞质中，其中IRAK-4、IRAK-1和TAK-1在细胞质中均匀分布，而MyD88、TRAF6和Tollip呈高度浓缩状态聚集，但该聚集状态是否与其细胞器定位相关还有待确定。以上结果对于揭示鱼类TLR9/21功能及其信号转导机制具有重要学术价值。