UL0.5基因对牛疱疹病毒1型/5型沿嗅神经通路侵入大脑的功能研究

嗜神经性是α疱疹病毒的重要特征。牛疱疹病毒1型（BHV-1）和5型（BHV-5）给养牛业造成重大的经济损失；二者DNA相似性为85%，但BHV-1仅在外周神经系统增殖，BHV-5却能侵入大脑。本课题根据BHV-1的独特长区比BHV-5多出一个UL0.5基因，推测该基因可能对BHV-1沿嗅神经通路侵入大脑起抑制作用，导致BHV-1与BHV-5神经致病性不同；进而利用同源重组方法构建BHV-1 UL0.5缺失病毒和表达UL0.5的BHV-5嵌合病毒，经鼻腔感染家兔，考察临床症状，开展定性和定量试验：用空斑法测定排毒量和排毒时间，用Real-time PCR测定病毒基因组在嗅球中的拷贝数，用免疫组织化学方法比较重组病毒与亲本病毒在前脑、中脑和后脑中的分布及感染神经元数量的差异，验证上述假设。本研究对揭示UL0.5的功能和BHV-1/5的嗜神经性差异有重要意义，对其它嗜神经病毒的研究也有借鉴作用。

本课题围绕牛传染性鼻气管炎病毒5型和1型的神经致病性差异，开展了以下研究。.(1)牛传染性鼻气管炎乳胶凝集试验诊断方法的建立和应用. 为了了解牛传染性鼻气管病毒在我国的流行状况，我们使用纯化病毒粒子免疫小鼠，获得2株单克隆抗体。建立了乳胶凝集试验方法（LAT）。用所建立的方法对来自内蒙古、新疆、江苏等地区的512份临床随机样品进行检测。共检测出177份阳性血清，其阳性率为34.6%。.(2) UL0.5的功能研究.牛疱疹病毒1型（BHV-1）和牛疱疹病毒5型（BHV-5）是两种非常相近的α疱疹病毒，两者DNA序列的相似性高达85%，氨基酸同源性为82%。牛疱疹病毒1型不具有中枢神经侵染力，通常引起牛传染性鼻气管炎（IBR）、妊娠母牛流产等，而牛疱疹病毒5型是嗜神经病毒，可侵入中枢神经系统（CNS），引起犊牛脑膜炎。通过基因组序列的比对分析发现，BHV-5所有的基因均能在BHV-1中找到与之对应的基因，但是BHV-1有一个独特的基因，即UL0.5，功能未知。.Western blot检测以及间接免疫荧光实验，证实了UL0.5编码的蛋白是BHV-1的结构蛋白。PAA实验证实了UL0.5为早期基因。将BHV-1 UL0.5缺失病毒和野毒分别感染实验兔，在急性感染期、潜伏感染期和再激活期分离眼拭子中的病毒进行空斑实验，绘制病毒分离滴度图。发现缺失UL0.5基因后，病毒能建立潜伏感染且依旧能够再激活，证明UL0.5是BHV-1的非必需基因。取三叉神经节、抽提总DNA，用保守的gB做探针进行绝对定量PCR实验。结果发现，缺失病毒在急性感染期、潜伏感染期和再激活期的基因组拷贝数比与野毒相比差异不明显。UL0.5基因插入BHV-5基因组后，嵌合病毒与野毒相比，增殖能力下降，并抑制了BHV-5对家兔的神经毒性。.(3) BHV-5自身的非编码基因研究.采用solexa测序技术，northern blot和stem-loop RT-PCR鉴定BHV-5的miRNA表达谱。结果表明，在BHV-5基因组上的17个位点编码11个不同的miRNA，能产生16个成熟的miRNA。与BHV-1编码的miRNA相比，两者都有数个miRNA分别分布在UL区和重复区，但仅有一个序列保守的miRNA。.(4) 发表SCI文章二篇，中文期刊1篇，申请专利一项。培养研究生8名。