聚酮合成起始单元选择的分子机制研究

Polyketides are a large group of secondary metabolites with complicated structures and diverse bioactivities generated by the repetitive decarboxylative condensation of short-chain carboxylic acids. Many of them have been clinically used as drugs. During the biosynthesis of polyketides, the acyltransferase (AT) domains of loading modules of polyketide synthases (PKSs) control the choice of starter units incorporated into polyketides and are therefore attractive targets for the engineering of PKSs. Although several key residues that affect the substrate specificity of loading AT domains have been identified by structural analysis in our previous research, the detailed mechanism is still unclear. In this proposal, we will use multiple methods to elucidate the molecular basis of the substrate specificity of loading AT domains. Special emphasis will be placed on 1) solving the crystal structures of loading ATs complexed with the substrates by X-ray crystallography to identify residues involved in substrate binding; 2) elucidating the effects of these residues on substrate binding by site-directed mutagenesis and in vitro functional assay; 3) solving the crystal structures of loading AT mutants to reveal the conformation changes of active sites; and 4) generating expected polyketides in vivo using suitable microbial hosts by engineering loading AT domains of PKSs with the resulting information.

聚酮是由短链羧酸连续脱羧聚合而形成的一大类化学结构复杂、生物活性多样的次级代谢产物，其中许多已经被用作临床药物。生物合成研究发现，聚酮合酶（PKS）起始模块中的酰基转移酶（AT）结构域决定聚酮合成起始单元的选择，是PKS设计改造的理想靶点之一。在前期的工作中我们解析了一个起始AT的晶体结构，并结合体外功能分析鉴定了一些参与底物结合的关键氨基酸，但详细的分子机制仍不清楚。本研究中我们将对起始AT底物特异性的分子机制进行系统研究：首先，解析起始AT与底物复合物的晶体结构，确定催化中心参与底物结合的关键位点；其次利用定点突变和体外功能分析验证这些关键位点氨基酸组成对底物特异性的影响；再次，解析突变体的晶体结构，并与野生型AT进行比较，分析催化中心的结构变化；最后，利用所得到的结果指导起始AT底物特异性的设计改造，将预期的起始单元引入到聚酮的生物合成，在微生物体内合成具有预期化学结构的聚酮产物。

聚酮是一大类结构复杂活性多样的次级代谢产物，由短链羧连续脱羧聚合形成，其中的许多已经被用作临床药物。在聚酮生物合成过程中，模块化聚酮合酶（modular polyketide synthases，mPKS）的酰基转移酶（acyltransferase，AT)结构负责选择聚酮链的起始单元和延伸单元，因此AT是mPKS设计改造的重要靶点。本研究中我们采用了多种方法研究AT结构域底物特异性的分子机制。阿维菌素PKS的起始AT（AveAT0）可以利用2-甲基丁酰辅酶A（Coenzyme A，CoA）和异丁酰CoA两种起始单元。前期工作中我们解析了AveAT0的晶体结构，基于结构的序列比对帮助我们确定了可能影响底物酰基部分识别的关键位点。通过突变AveAT0的酰基结合口袋，我们得到了对2-甲基丁酰辅酶A特异性提高的AveAT0突变体。盐霉素是具有抗菌和抗球虫活性的聚醚类聚酮化合物，已经被商业化应用，在畜牧业中作为饲料添加剂。盐霉素的合成前体包括丙二酰CoA（Malonyl-CoA，MCoA), 甲基丙二酰CoA（methylmalonyl-CoA，MMCoA)，和乙基丙二酰CoA（ethylmalonyl-CoA，EMCoA)。为了理性盐霉素mPKS中的AT如何区分识别这三种底物，我们解析三种不同AT的晶体结构，利用分子动力学模拟鉴定了参与底物识别的位点，并以此为基础构建了底物特异性发生转换的突变体。这些突变体的催化效率接近野生型AT的效率。某些AT识别的底物由酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）而不是CoA携带。这些由ACP携带的合成前体常常具有特殊的C2位功能基团。在本研究中我们解析氨丝菌素mPKS第三个模块中识别氧甲基丙二酰ACP（methoxymalonyl-ACP，MOMACP）的AT的晶体结构，并进行了体外生化分析。结果显示这个AT利用底物口袋入口处保守的色氨酸区分底物中的CoA和ACP载体部分，其W275R突变体对ACP和CoA分子的特异性发生转换。由于MOM-ACP的前体是糖酵解途径中的D型中间体，人们普遍认为MOM-ACP具有2R构型，AT-MOM复合物晶体结构清楚的显示该AT利用2S型底物，说明MOM-ACP合成过程中需要一步异构化步骤。这些结果为AT的底物特异性设计改造提供了基础。