阿片受体拮抗剂纳洛酮通过Tet1调控神经干细胞增殖的机制研究

The differential regulation of opioids on proliferation and differentiation of neural stem cells under different systems suggests the existence of receptor-independent pathways. The team used opioid receptor knockout neural stem cells and analogs with different functional characteristics and found that opioid receptor antagonist (naloxone) promotes neural stem cell proliferation through receptor-independent pathway. Further experiments indicated that the ability of naloxone to promote neural stem cell proliferation is dependent on TET1. Accordingly, the team proposed that naloxone regulates neural stem cell proliferation through direct binding to TET1 protein. Based on the determination of the direct binding of naloxone to TET1, this project aims to screen the amino acids in TET1 that participate in the response to naloxone, determine the regulation of naloxone on the DNA demethylation activity of TET1, reveals the expression regulation of downstream genes of TET1. Thus, the mechanisms by which naloxone regulates the proliferation of neural stem cells through TET1 will be fully analyzed. At the same time, the team will try to verify the effects of the direct interaction of naloxone with TET1 protein on adult neurogenesis and spatial learning and memory in mice. This study will provide new insights for investigating the complex functions of opioids in the central nervous system.

不同体系下阿片类药物对神经干细胞增殖和分化的差异性调控作用提示非受体依赖性通路的存在。研究团队利用敲除阿片受体的神经干细胞以及具有不同功能特点的类似物发现：阿片受体拮抗剂（纳洛酮）通过非受体依赖性通路促进神经干细胞增殖。进一步实验表明纳洛酮促进神经干细胞增殖的能力依赖于TET1。据此，团队提出纳洛酮通过与TET1蛋白的直接结合调控神经干细胞增殖的科学假说。本项目拟在确定纳洛酮与TET1蛋白的直接结合能力的基础上，筛选TET1蛋白中参与响应纳洛酮的氨基酸位点，确定纳洛酮对TET1蛋白DNA去甲基化活性的调控作用，揭示TET1蛋白下游基因受到的表达调控，从而完整解析纳洛酮通过TET1调控神经干细胞增殖的具体机制。同时，团队还将尝试在动物模型中验证纳洛酮与TET1蛋白的直接相互作用对成体神经发生及小鼠空间学习记忆能力的调控。本研究将为进一步探讨阿片类药物在中枢神经系统中的复杂功能提供新的思路。

阿片类药物对神经干细胞调控作用的复杂性很难用其对阿片受体的选择性解释，推测它们可能通过阿片受体外途径调控神经干细胞增殖和分化。团队前期研究利用具有不同功能特点的纳洛酮类似物发现阿片受体拮抗剂纳洛酮对神经干细胞增殖的促进作用与阿片受体无关，而是依赖于DNA去甲基化酶Tet1。本项目计划进一步确认纳洛酮是否通过非阿片受体途径调控神经干细胞增殖。筛选TET1蛋白中参与响应纳洛酮的氨基酸位点，确定纳洛酮对TET1蛋白DNA去甲基化活性的调控作用，揭示TET1蛋白下游基因受到的表达调控，从而完整解析纳洛酮通过TET1调控神经干细胞增殖的具体机制。同时，在动物模型中验证纳洛酮与TET1蛋白的直接相互作用对成体神经发生及小鼠空间学习记忆能力的调控。.团队研究发现：1）敲除阿片受体编码基因Oprm1、Oprd1或Oprk1后，纳洛酮和吗啡依然可以促进神经干细胞增殖；2）纳洛酮直接结合TET1蛋白并抑制其DNA去甲基化活性，提高基因组DNA的甲基化水平；3）将Tet1CD的1880-1882位氨基酸突变为丙氨酸（A）后，纳洛酮和吗啡不能促进神经干细胞增殖；4）纳洛酮处理促进小鼠海马区神经干细胞增殖和向神经元分化，水迷宫实验中，纳洛酮增强高难度条件下小鼠的空间学习和记忆能力。.在上述研究的基础上，团队研究了纳洛酮和吗啡对神经干细胞分化方向的调控作用，确定了在神经干细胞分化早期，纳洛酮和吗啡通过Tet1促进神经干细胞向神经元分化。.本项目阐明了Tet1在纳洛酮和吗啡调控神经干细胞增殖和分化中的功能，明确了非阿片受体途径在阿片类药物发挥功能中的作用，为研究阿片类药物调控神经系统功能提供了新的思路。2020-2022年合计发表项目标注论文4篇，申请专利1项，1项专利已经与专利代理公司签订协议。