外泌体miRNA-19a对胰腺癌相关糖尿病的胰岛素分泌的影响及机制

Researches showed that pancreatic cancer can secrete exosomes, through which influence the adjacent cells and affect the function of target cells in order to alter the microenvironment. Our previous studies suggested that exosomes derived from pancreatic cancer cells can downregulate the insulin secretion from pancreatic β cells under high-glucose condition. The pancreatic cancer derived-exosomal miRNA-19a were found to be a potential signal molecule and might to be implicated in the pathogenesis of pancreatic cancer-induced diabetes mellitus (PaCDM) by quantitative real time PCR (qRT-PCR) analysis and bioinformatics, by targeting the ADCY1 gene expression and suppression of insulin releasing. We try to explore the effects and mechanisms of miRNA-19a contained in pancreatic cancer cells-derived exosomes, by exploiting indirect cellular co-cultures, interference of gene expression by lentivirus and exosomes tracer techniques, etc., on the dysfunction of insulin secretion in vivo and in vitro by targeting the ADCY1 and the downstream signal pathways. This study will help to investigate the role of exosomes and miRNAs in the pathogenesis of PaCDM, and might provide a valuable strategy for the early diagnosis of pancreatic cancer.

研究表明胰腺癌可分泌外泌体并作用于多种胰腺癌旁细胞来调节靶细胞的功能从而改变肿瘤生长的微环境。初步研究结果提示源于胰腺癌的外泌体可诱导高糖状态下胰岛β细胞的胰岛素分泌量下降。qRT-PCR检测数据及生物信息学分析等结果也提示源于胰腺癌并富集于外泌体中的miRNA-19a可能是一种重要的信号分子，并可能通过靶向下调胰岛β细胞的ADCY1基因表达并进而抑制胰岛素释放，参与了胰腺癌相关糖尿病的发生。本课题拟通过体内及体外实验，应用细胞非接触式共培养、慢病毒干扰基因表达、外泌体示踪等相关分子细胞生物学技术，探讨胰腺癌分泌的miRNA-19a通过外泌体靶向作用于胰岛β细胞ADCY1基因并通过下游信号的改变来诱导胰岛素释放下降，从而诱导胰腺癌相关糖尿病的发病过程。本课题的完成将有助于阐明外泌体及miRNA-19a在胰腺癌相关性糖尿病发病中的作用，并可能为胰腺癌的早期诊断提供预警指标。

胰腺癌早期诊断困难，新发糖尿病可能是胰腺癌的伴癌综合征，其发病原因尚不清楚。确立胰腺癌相关糖尿病的发病机制可能对制订从新发糖尿病人群中筛选胰腺癌的策略有很大参考价值。本课题立足于研究胰腺癌分泌的外泌体中包含的miR-19a对于癌旁胰岛细胞的胰岛素分泌的调控作用及机制。首先，应用商品化外泌体抽提试剂盒提取胰腺癌细胞系培养液中的外泌体，应用电镜、NTA及标志蛋白鉴定等方法验证提取成功，并应用Dil-C16染色方法证实了胰腺癌细胞来源的外泌体可进入胰岛细胞中。胰腺癌外泌体分别可引起胰岛细胞系MIN6以及小鼠原代胰岛的糖刺激下胰岛素分泌（GSIS）下降。通过生物信息学分析及相关后续的体外分子生物学验证实验，包括Western blot、qRT-PCR、双荧光素酶报告试验等，课题组发现了在胰岛素分泌路径中起到重要作用的两个基因，ADCY1和EPAC2，都是miR-19a的靶基因。同时，参与胰岛素合成的重要基因NEUROD1也是miR-19a的靶基因。而后，课题组应用慢病毒转染方式构建了稳定低表达miR-19a的小鼠胰腺癌PAN02细胞系，再进行裸鼠胰腺原位植瘤，进行体内功能实验及原代提取胰岛的相关蛋白质和RNA检测，进一步验证了胰腺癌来源的miR-19a主要通过减少胰岛细胞的胰岛素量而非降低胰岛素在外周组织器官的利用上，诱导了机体糖代谢紊乱过程。相关研究数据经整理后，分别在International Journal of Biological Science和Molecular Biology Reports上各发表研究论文1篇。本课题研究通过对胰腺癌相关糖尿病发病机制的解析，为探索寻找从新发糖尿病群体中筛查早期胰腺癌的分子标志物研究方面打下了一定的基础。