牛肌生成抑制素相互作用蛋白筛选与功能研究

肌生成抑制素是骨骼肌生长负调控因子，减弱或抑制肌生成抑制素的功能在畜牧业和临床医学上具有重要意义，而弄清肌生成抑制素调控机理是对肌生成抑制素功能调控成功的关键。本研究首先利用酵母双杂交技术从牛骨骼肌组织中筛选与牛肌生成抑制素发生相互作用的蛋白质，然后用GST Pull down、免疫共沉淀和细胞内免疫共定位等技术对筛选到的蛋白进行验证，进而发现与牛肌生成抑制素相互作用的蛋白质，随后用表面等离子共振技术研究筛选到的蛋白与牛肌生成抑制素相互作用特异性、动力学规律和亲和力，最后用定向克隆、基因转染、细胞培养、Western-blotting、实时定量荧光PCR和RNA干扰等技术系统研究牛骨骼肌中与肌生成抑制素相互作用蛋白的生物学功能。本研究发现牛肌生成抑制素相互作用蛋白，明确其生物学功能，为深入研究牛肌生成抑制素调控肌肉生长提供理论基础，从而更好地为畜牧业发展提供技术支持。

肌生成抑制素（MSTN）是骨骼肌生长的负调控因子，抑制MSTN的功能在畜牧业和临床医学上具有重要意义，而阐明MSTN的调控机制是对MSTN功能调控成功的关键。本项目筛选了牛骨骼肌细胞中与MSTN相互作用的蛋白，并采用免疫共沉淀技术、GST Pull down等技术对筛选到的蛋白进行鉴定，然后利用SPR技术研究这些蛋白质与MSTN相互作用的动力学规律，最后利用基因过表达和RNA干扰等技术研究了MSTN互作蛋白的生物学功能。结果从牛骨骼肌中筛选出MSTN相互作用蛋白4个，利用GST pull down 和蛋白质免疫共沉淀技术从体内体外验证了MSTN相互作用蛋白。利用SPR技术定量研究了MSTN与Decorin、Fibromodulin、T-CAP和TDGF1蛋白相互作用动力学，发现TDGF1相互作用最强。过表达TDGF1基因可抑制成肌细胞增殖，在48h作用最大；添加不同浓度MSTN有同样效果，且过表达TDGF1和同时添加MSTN对成肌细胞增殖的抑制作用最大；进一步研究发现，TDGF1可通过激活MSTN信号通路---Smad蛋白磷酸化和下调MyoD1基因表达而抑制成肌细胞增殖。沉默TDGF1基因可促进成肌细胞增殖，且在48h作用最强，而添加不同浓度的MSTN可显著降低这种作用，且在10μM抑制作用最强，提示TDGF1是MSTN调控成肌细胞增殖的下游分子。沉默TDGF1基因可导致MyoD1、Myf5基因表达量上调和Smad蛋白磷酸化水平降低，添加MSTN可抑制MyoD1基因表达量上调，但对Myf5基因表达量无影响，说明MSTN需要TDGF1基因介导进而通过下调MyoD1基因的表达量从而抑制成肌细胞增殖作用。综合过基因表达和RNA干扰实验结果，MSTN可通过TDGF1激活其信号通路，启动Smad蛋白磷酸化，导致MyoD1基因表达量显著下调从而抑制成肌细胞的增殖作用。上述研究结果不仅为阐明牛MSTN的调控机制提供科学参考，而且也为牛MSTN的调控打开新的思路。