Dlx2/Fgf9/p53信号通路在颅神经嵴细胞发育中的作用研究

Our previous study revealed that Dlx2 over-expression could lead to neural tube defect, mid-facial cleft and spinal deformity, and these craniofacial deformities may due to the decreased cell proliferation, increased cell apoptosis, abnormal chondrogenesis and impaired osteogenesis within the cranial neural crest cell (CNCCs) population. Additionally, Dlx2 over-expression could up-regulate the expression of Fgf9 and p53, and previous studies demonstrated that Fgf9 plays crucial roles in the chondrogenic and osteogeneic differentiation of CNCCs, whereas p53 mainly regulate the cell proliferation and apoptosis. All of above finds imply that Fgf9 and p53 may be involved in abnormal proliferation, apoptosis and differentiation of CNCCs induced by Dlx2 over-expression. In this study, based on the transgenic mouse model for neural crest cell specific Dlx2 over-expression, we will try to study the interactions and molecular mechanisms between Dlx2, Fgf9 and p53 during CNCCs development by using organ culture, cell culture, virus transfection, RNA interference, bioinformatic analysis and promoter point mutation, etc, and to find out the suitable drug delivery methods for Fgf9 gene therapy and pharmacological inhibition of p53 to rescue the Dlx2 over-expression induced craniofacial deformities, which will be useful for prevention, diagnosis and treatment for these craniofacial deformities.

我们前期研究发现Dlx2过表达可引起小鼠神经管裂开、面裂和脊柱裂开、脊柱弯曲畸形。其颅颌面畸形的发生与颅神经嵴细胞增殖降低而凋亡增加、成软骨分化增强而成骨分化发生障碍有关。此外，Dlx2过表达可引起Fgf9和p53表达发生改变，以往研究表明Fgf9对颅神经嵴细胞骨/软骨向分化有重要影响，而p53主要调控细胞的增殖和凋亡，提示Fgf9和p53可能参与Dlx2过表达引起颅神经嵴细胞增殖、凋亡和分化异常。本研究以前期建立的Dlx2在神经嵴细胞特异性过表达转基因小鼠模型为基础，应用鳃弓器官体外培养、颅神经嵴细胞培养、病毒转染、RNA干扰、生物信息学分析和启动子点突变等技术，研究Dlx2、Fgf9和p53在调控颅神经嵴细胞发育中的相互作用及分子机制，探索Fgf9基因治疗和p53药物抑制在挽救Dlx2过表达引起的先天性颅颌面畸形中的药物投递方案及可行性，有望为临床上预防和诊治相关疾病提供一定理论基础。

转录因子Dlx2是同源盒基因家族的一员，其在神经嵴细胞发育中具有重要的调控作用。我们前期建立的Dlx2在神经嵴细胞特异性过表达转基因小鼠表现为神经管裂开、面裂、脊柱弯曲等畸形。但表型分析尚不完全，分子机制尚不清楚。本项目应用大体观察，Micro CR,组织学检查等方法研究发现Dlx2在神经嵴细胞过表达可引起成年小鼠下颌骨髁突发育障碍包括髁突软骨结构紊乱、软骨下骨骨质疏松。Dlx2在神经嵴细胞过表达还可引起成年小鼠切牙反颌、牙根缩短、牙骨质沉积增加、牙周膜结构紊乱及牙槽骨骨质疏松。此外，Dlx2过表达可引起颅底碟枕联合发育障碍，碟枕联合软骨结构紊乱，小脑发育不足。进一步应用病毒转染，ChiP, Co-IP和定点突变等方法明确了Dlx2可与Msx2结合形成转录复合体，结合到OCN基因特定的启动子序列，影响OCN基因的表达，调控间充质干细胞的成骨分化。Dlx2还能直接靶向结合于MMP13的启动子区域，抑制MMP13的转录水平，使细胞旁分泌的MMP13的含量降低，调控间充质细胞的软骨向分化。我们也发现FGF9可抑制骨髓基质干细胞、颅骨来源的间充质细胞和牙髓干细胞在体外的成骨分化。在骨髓基质干细胞中，ERK1/2通路介导了外源性FGF9对体外培养的骨髓基质干细胞的成骨分化抑制作用。在颅骨间充质细胞中，MAPK通路并未参与FGF9对颅骨间充质细胞的体外成骨分化的抑制作用。在牙髓干细胞中，ERK1/2通路和JNK通路同时参加了FGF9对牙髓干细胞体外成骨分化的抑制作用。生物信息学分析提示Dlx2和Msx2通过转录复合体，共表达及共定位等形式相互联系，可能在颅颌面的发育过程中存在相互作用。Msx2，TCOF1和IRF6在调控颅颌面发育中与许多基因存在重要的分子调控网络，这些基因可富集到不同的生物学功能子集。最后，建立了创伤性颞下颌关节强直小鼠和大鼠模型，研究发现损伤的髁突软骨而不是骨在关节强直的发生中具有重要意义。异体骨髓间充质干细胞尾静脉注射可降低炎症反应，促进创伤性颞下颌关节强直中残留髁突的再发育。研究结果为Dlx2相关先天性颅颌面疾病的分子诊断、分子及干细胞与基因治疗积累提供了思路。