蒙医温针调节失眠大鼠miRNAs及PAX8/APP蛋白治疗失眠症的机制研究

Insomnia, as the most common sleep disorder, has high prevalence rate and easily induces other diseases. There remains no safe and effective method for treating insomnia hitherto. Traditional Mongolian medicine has attributed insomnia to “Imbalance between Three Origins and Hypervigorous Heyi”, which can be treated by using warm needle acupuncture efficiently, safely and readily, without depending on drugs. We have previously demonstrated that warm needle acupuncture could prolong the sleep time of an insomniac rat model, and regulated neurotransmitters such as 5-hydroxytryptamine and dopamine. In this project, based on the theory of traditional Mongolian medicine, we aimed to compare the levels of miRNAs in an insomniac rat model before and after warm needle acupuncture, and to clarify the role of miR-101a in predicting the regulatory effects of target gene PAX8/APP protein by using quantitative fluorescent PCR, chromatin coprecipitation assay, luciferase reporter assay, etc. Besides, the regulatory pattern of the signaling transduction pathway in insomnia was studied. Moreover, the neurotransmitters associated with awakening-sleep were analyzed. By combining clinical studies, we also revealed the biological mechanism by which warm needle acupuncture improved sleep. The results provide modern molecular biology evidence for traditional ethnomedicine, elucidate the role of warm needle acupuncture on the gene level, and inspire future treatment of insomnia and development of ethnomedicine.

失眠症是最常见的睡眠障碍性疾患，患病率高且容易引起多种疾病的患病风险，目前缺乏安全有效的治疗方法。传统蒙医认为失眠属于“三根失衡，赫依偏盛”引起的疾病，采用温针治疗失眠高效、安全、简单且不产生药物依赖。本课题组前期研究证明蒙医温针能够延长失眠模型大鼠的睡眠时间；调节5-羟色胺、多巴胺等神经递质。本项目基于蒙医理论，拟比对温针治疗失眠大鼠模型前后miRNAs水平变化，通过荧光定量PCR、染色质共沉淀、荧光素酶报告基因等不同方法明确miR-101a对其预测靶基因PAX8及APP的调节作用；进而研究相关信号传导通路在失眠症中的调控模式；结合临床试验，揭示蒙医温针改善睡眠的生物学机制。该研究将为传统民族医学疗法奠定现代分子生物学机制理论基础，在基因水平层面阐释蒙医温针的效用原理，对推动失眠症的治疗及民族医学的发展起到积极的作用。

现代医学对失眠的研究发现睡眠-觉醒是一个涉及多系统、多中枢的协调整.合的生理过程，具有复杂的调节机制。蒙医对温针治疗指标的定量定性并无统一标准，只考察几个神经递质的指标不能完全代表整个机体的生理指数，不符合整体观的蒙医理论。蒙医温针的机理十分复杂，较难从某个生理指标去分析掌握，但机体内miRNAs 的改变可以进行标准化、客观化的测定。因此我们以miRNAs为介质研究蒙医温针既能体现出宏观性和整体性，又能符合现代分子生物技术的微观性和针对性。.1. 我们通过芯片数据分析发现，相对于正常大鼠，蒙医温针治疗后，有141个miRNAs表达存在差异；变化最为显著的为miR-101a，相比模型组升高了98倍。我们接下来对15只温针治疗失眠大鼠的miR-101a的水平进行了荧光实时定量PCR研究，发现中位数由模型组的的-2.9倍上升到了3.2倍；.2.蛋白印迹、荧光PCR、荧光素酶报告、免疫荧光灯多种方法证实了相对于失眠大鼠模型组，蒙医温针治疗组中miR-101a的表达水平相对升高，转染miR-101a inhibitor能成功降低细胞中内源性miR-101a的表达。同时验证了蒙医温针改善失眠的原理与miR-101a 调节PAX8/APP基因有直接关联；.3.通过上述关联为基础，对多种细胞因子及神经递质调节网络进行了验证，失眠大鼠下丘脑、海马和大脑前额叶皮质组织中白细胞介素IL-1、IL-2、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平与空白对照组相比明显降低，经过治疗后，无论是温针治疗还是西药治疗，各部位白细胞介素IL-1、IL-2、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平与模型组相比均显著提升。失眠大鼠以上各部位NE、DA、Glu水平明显高于空白对照组，差异显著，而经过温针或西药治疗，NE、DA、Glu水平则与失眠模型组相比较有了明显降低，失眠模型组大鼠下丘脑5-HT、GABA、Ach水平明显低于空白对照组，差异显著，与失眠模型组比较，温针或西药治疗后失眠大鼠下丘脑5-HT、GABA、Ach水平明显升高，差异显著，说明蒙医温针对治疗大鼠失眠有显著效果，与药物治疗基本效果相当甚至更好。为今后蒙医温针的现代治疗提供生物学的研究证明，为传统民族医药的现代化发展提供科学支持。