γδ T 细胞及TLR信号通路在新生儿坏死性小肠结肠炎免疫调节中的作用机制

Neonatal necrotizing colitis (NEC) has high morbidity and mortality. The pathogenesis of NEC is complex. Because of most of γ δ T cells distribute among the intestinal epithelial cells, and the different TLRs express on their surface.The signaling pathway of gammadelta T cells located among intestinal epithelial cells and TLR expressed on their surface may play an important role of immunoregulation in NEC. We use such as flow cytometric, immune resistance, RT-PCR methods and so on to analysis the gammadelta T cells and its TLR expressions using necrosis intestinal epithelium took from NEC patients, and also, we use different TLR ligands to stimulate the gammadelta T cells that were separated and purificated from the necrosis intestinal to understand the effact of the proliferation,activation and cytokines secretion of γ δ T cell.At the same time , we also analyze if the signaling pathway also influence the intestinal epithelium cell apoptosis or hyperplasia.On the other hand, we establish NEC model with the different γ δ T cells and TLR gene knockout mice, and use different TLR ligands to stimulate mice in vivo, comparing different model of the intestinal epithelium cell apoptosis and growth condition, also includingγ δ T cells expressions, and further analyzes this signalling pathways play such kind of immunoregulation roles on NEC. Through those above researches, we try to understand the different γ δ T cells and TLR signaling pathways may play different immunoregulation roles in NEC, That may provide us with the further understanding about the immune defenses of NEC, so we can have some theory basis about how to treat NEC.

新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）有很高的发病率和死亡率。NEC发病机制复杂,由于γ δ T 在肠道间存在优势分布，其表面表达不同的TLR，因此我们推断肠道上皮细胞间的γδT细胞和其表面TLR信号通路可能发挥着重要的免疫调节作用。我们建立γδT细胞及不同TLR基因敲除小鼠的NEC模型，同时小鼠体内使用TLR配体刺激，通过流式细胞仪、免疫阻化和RT-PCR等方法比较不同模型中的肠道上皮细胞的凋亡、增殖情况和γδT细胞的表达变化，分析此信号通路对NEC的免疫调节作用以及探讨将来可能的治疗手段；同时我们分析NEC病人的坏死肠上皮间的γδT细胞及其TLR的表达，不同TLR配体对分离纯化的γδT细胞进行体外刺激，进一步分析此信号通过对肠道上皮细胞的凋亡或增生的影响。通过以上研究，了解γδT细胞和TLR信号通路对NEC的免疫调节作用，为今后深入研究NEC免疫防御机制提供理论依据。

新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）有很高的发病率和死亡率。NEC发病机制复杂,由于γ δ T 在肠道间存在优势分布，其表面表达不同的TLR，因此我们推断肠道上皮细胞间的γδT细胞和其表面TLR信号通路可能发挥着重要的免疫调节作用。我们通过流式细胞仪、免疫阻化和RT-PCR等方法分析NEC病人的坏死肠上皮间的γδT细胞及其TLR的表达，使用不同TLR配体对分离纯化的γδT细胞进行刺激，了解γδT细胞的增殖活化和细胞因子的分泌状况，并分析此信号通过对肠道上皮细胞的凋亡或增生的影响；同时建立γδT细胞基因敲除小鼠，TLR4/TLR9敲除小鼠的NEC模型，比较不同模型中的肠道上皮细胞的凋亡、增殖情况和γδT细胞的表达变化，进一步分析此信号通路对NEC的免疫调节作用。通过以上研究，了解不同的γδT细胞和TLR信号通路调节作用不同，为今后深入研究NEC的免疫防御机制提供理论依据。对于NEC患儿的坏死肠段，采用流式细胞仪发现坏死性小肠段的γδT细胞表达增强，TLR4的表达也显著增强，而TLR9的表达无明显差异。在坏死肠段采用免疫组化，PT-PCR等方法检测IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17，INF-r,TNF-a的表达，发现在坏死肠段IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，INF-r,TNF-a显著增加，PCR也发现相同的结果。在坏死肠道取出的大便，分析其大便中的菌群DNA分类，发现G-菌，如大肠杆菌，肺炎克雷伯杆菌等均显著增加。在不同基因敲除小鼠的NEC模型中发现，TLR4基因敲除小鼠的NEC肠段坏死情况显著低于TLR9基因敲除小鼠，其诱导的细胞因子也有显著差异。.通过以上研究发现γδT细胞，TLR9的信号系统激活可以对新生儿肠道起到相对保护作用，而G-菌/TLR4信号系统的激活可以加重肠道的炎症反应，加重肠道坏死。通过以上研究，可以帮助我们更加深入认识NEC的发病机制，为今后临床中可能对NEC采取的干预措施提供理论依据。