可注射型瘦素抑制剂缓释水凝胶治疗骨性关节炎及其机制研究

Chondrocytes as the single cellular component incartilage play key roles in the development of osteoarthritis. Cell autophagy is an important balance mechanism for maintaining the normal metabolism of chondrocytes. MTORC1 is a key inhibitor of cell autophagy. Preliminary studies have found for the first time that LOXL3 levels are significantly upregulated by leptin in chondrocytes, and LOXL3 mRNA expression is positively correlated with leptin levels in rat osteoarthritis model. Leptin induced LOXL3 expression and inhibited the autophagy of chondrocytes via activating mTORC1. Accordingly, LOXL3 is a new promising potential therapeutic target for osteoarthritis. However, the specific molecular mechanism of the activation of mTORC1 by LOXL3 remains not clear. By using immunoprecipitation and mass spectrometry methods, we found that LOXL3 may have mediated the activation of mTORC1 through interacts with Rheb. In this study, we intend to clarify the molecular mechanism of LOXL3 activates mTORC1 and then regulates chondrocyte autophagy through interacts with Rheb by using cell and molecular biology techniques. We will also synthesize leptin inhibitor sustained release thermosensitive hydrogel, and clarify its effect on the repair of osteoarthritis by using molecular biology methods, immunohistochemistry and biomechanics tests in a rat model. This project would provide novel targets and ideas for targeted therapy for osteoarthritis.

软骨细胞作为软骨内唯一的细胞成分，在骨性关节炎发生发展过程中起关键作用。细胞自噬是维持软骨细胞正常代谢的重要平衡机制。mTORC1是细胞自噬的关键抑制元件。我们首次发现，在大鼠骨性关节炎模型中LOXL3表达与瘦素水平呈正相关，瘦素通过刺激LOXL3表达上调进而激活mTORC1抑制软骨细胞自噬。LOXL3可能是一个新的骨性关节炎潜在治疗靶点，但LOXL3激活mTORC1的具体分子机制尚不明确。我们前期通过免疫沉淀与质谱技术发现LOXL3与Rheb可能相互作用介导了mTORC1的激活。为此，本项目拟利用细胞与分子生物学技术阐明LOXL3通过与Rheb相互作用激活mTORC1进而调控软骨细胞自噬的分子机制；制备瘦素抑制剂缓释温敏型水凝胶，利用分子生物学、免疫组织化学与生物力学等方法，明确其对骨性关节炎大鼠模型的修复效果。本项目为骨性关节炎的靶向治疗提供新的靶点和思路。

软骨细胞作为软骨内唯一的细胞成分，在骨性关节炎发生发展过程中起关键作用。细胞自噬是维持软骨细胞正常代谢的重要平衡机制。mTORC1是细胞自噬的关键抑制元件。我们首次发现，在大鼠骨性关节炎模型中LOXL3表达与瘦素水平呈正相关，瘦素通过刺激LOXL3表达上调进而激活mTORC1抑制软骨细胞自噬。LOXL3可能是一个新的骨性关节炎潜在治疗靶点，但LOXL3激活mTORC1的具体分子机制尚不明确。本项目建立了大鼠骨性关节炎模型，培养原代软骨细胞，制备LOXL3过表达慢病毒并合成了siLOXL3转染原代软骨细胞，RT-PCR和Western Blot检测了自噬相关蛋白的表达量，透射电镜观察了各组细胞自噬小体在细胞内的聚集情况。采用免疫印迹检测了LOXL3与Rheb在软骨细胞中的相互作用，证实了LOXL3通过与Rheb相互作用激活mTORC1进而调控软骨细胞自噬。为以LOXL3为靶点的骨性关节炎靶向治疗提供数据支持和理论依据。同时，项目组制备了瘦素抗体缓释温敏型水凝胶，完成了温敏性质测定、扫描电镜形貌观察和体外释放实验。构建了大鼠骨性关节炎模型，评估了各组间形态差异及组织学差异。完成了各组标本的collagen II和Aggrecan免疫组化染色。实时定量RT-PCR法分别检测了各组LOXL3、Rheb、LC3I、LC3II、Beclin1、p-p70S6K、p70S6K等基因表达情况。Western Blot分别检测了各组LOXL3、Rheb、LC3I、LC3II、Beclin1、p-p70S6K、p70S6K等蛋白表达情况，评估了不同组间骨性关节炎进展情况。结果显示：瘦素抗体缓释温敏型水凝胶能通过抑制LOXL3减轻及修复大鼠骨性关节炎的严重程度。本项目明确了水凝胶对大鼠骨性关节炎的治疗效果，为后续的临床治疗应用研究提供科学参考依据。