sRNA与群体感应系统相互作用调控乳杆菌细菌素合成机制研究

Bacterial sRNAs are a class of non-coding RNAs with 40-500 nt. These sRNAs play important roles in response to environmental stress. Interaction of sRNA and quorum sensing(QS) system plays an extensive role in the regulation of life activities in bacteria. On the basis of the research of QS regulation in bacteriocinogenic Lactobacillus spp., this project will clone sRNAs using shot-gun cloning approach,then Lactobacillus spp. sRNAs will be selected. The environmental stress associated sRNAs in Lactobacillus spp. will be identified by Northern blotting, real-time fluorescent quantitative RT-PCR,etc. The target genes of candiate sRNAs will be predicted using bioinformatics software, the target genes related to bacteriocin synthesis in Lactobacillus spp. will be selected, then they will be further verified. A series of gene deletion mutants including hpk and rr, components of quorum sensing system in bacteriocinogenic Lactobacillus spp., gene deletion mutants or sRNA gene deletion mutants and the corresponding complementary strains will be constructed, then the function of sRNA in bacteriocin synthesis and the effect of the interaction between sRNA and QS system on bacteriocin synthesis will be studied to reveal the molecular mechanism of the effect of environmental stress factor on bacteriocin production in Lactobacillus spp.. The results not only provide a theoretical basis for stable expression of bacteriocin in Lactobacillus spp., but also lay foundation for the application of bacteriocinogenic Lactobacillus spp.in food.

sRNA是细菌中普遍存在的一类长度为40-500nt的非编码RNA，在对环境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。sRNA和群体感应(quorum sensing,QS)系统交互作用，在细菌生命活动过程中发挥着广泛的调控作用。本项目在产细菌素乳杆菌QS调控研究的基础上，采用鸟枪克隆法克隆sRNA，筛选乳杆菌sRNA，并经Northern杂交、实时荧光定量RT-PCR等确定环境胁迫相关sRNA；利用生物信息学软件对候选sRNA进行靶基因预测，选择与乳杆菌细菌素合成相关靶基因进行验证；构建乳杆菌sRNA基因、靶基因以及QS系统组分hpk、rr缺失突变株及其互补株，研究sRNA在细菌素合成中的作用以及sRNA与QS系统相互作用对乳杆菌细菌素合成的影响，解析环境胁迫因子影响乳杆菌细菌素合成的分子机制。研究结果不仅可为实现乳杆菌细菌素的稳定表达提供理论依据，同时也可为产细菌素乳杆菌在食品中的应用奠定基础。

sRNA是细菌中普遍存在的一类长度在40-500nt的非编码RNA，多作为环境压力的调节元件。sRNA和群体感应(quorum sensing,QS)系统交互作用，在细菌的生命活动过程中发挥着广泛的调控作用。本研究依据类植物乳杆菌应用于肉类发酵可能面临的环境，设计并实施了多个模拟胁迫条件，筛选到了影响细菌素合成的3种条件，包括温度、乙醇、NaNO2。收集Lactobacillus paraplantarum L-ZS9在45℃、6%乙醇、0.10g/L NaNO2条件下培养20h菌体，提取总RNA，进行转录组测序（RNA-seq）。共预测出258种候选sRNA，结合荧光定量RT-PCR 技术对部分候选sRNA进行验证分析，筛选得到了与0.10g/L NaNO2胁迫相关的四种sRNA：LpaL_196、LpaL_142、LpaL_239、LpaL_162。鉴于LpaL_196 的靶标基因包含QS系统组氨酸蛋白激酶基因plnB(hpk)，选取该sRNA进行进一步分析。运用融合PCR和同源重组技术敲除构建LpaL_196突变株△LpaL_196,通过自杀质粒载体分别构建QS系统感应调节蛋白基因plnD（rr）以及LpaL_196 的靶标基因plnB的插入失活突变株,利用pMG36e质粒构建其互补株。细菌素活性检测结果显示，△LpaL_196、△plnD及其互补株与野生菌株L-ZS9相比细菌素合成差异不显著。△plnB未能检测到细菌素活性，其互补株与野生菌株L-ZS9相比抑菌效果差异不显著，可见plnB基因缺失影响细菌素的合成。△plnD、△LpaL_196对NaNO2无响应，其相应的互补株细菌素的合成受NaNO2的影响，抑菌圈直径变小，提示plnD、LpaL_196与NaNO2胁迫相关。荧光定量RT-PCR结果显示，与L-ZS9菌株相比，△plnD菌株LpaL_196表达水平上调，说明plnD对LpaL_196有负调控作用；△plnB菌株LpaL_196表达水平未发生显著变化；△LpaL_196菌株plnD表达水平未发生显著变化，plnB基因表达量下调1.464倍，说明△LpaL_196对plnB有正调控作用。该研究结果不仅可为实现L-ZS9菌株细菌素的稳定表达奠定基础，同时也可为产细菌素乳杆菌在食品中的应用提供理论依据。