坛紫菜不同世代光合碳同化途径的比较分析

坛紫菜是一种低等的真核红藻，也是我国特有的人工栽培种。坛紫菜具有两个多细胞表型和两个单细胞表型，不同世代间的形态和生物学特征显著不同。我们的前期研究工作表明，丝状孢子体阶段可能存在高效的PCK型C4固碳途径，并且不同世代中光合碳同化途径极有可能明显不同。本项目旨在获得可能存在于坛紫菜丝状孢子体阶段的PCK亚型C4光合固碳途径中的关键酶（PEPC、PEPCK、PPDK、CA、苹果酸酶和苹果酸脱氢酶等）的全长基因，测定这些关键酶在坛紫菜丝状孢子体与叶状配子体中的酶活及表达差异，并对其进行细胞定位，比较光合碳同化途径在不同世代中的异同；通过比较分析丝状体、壳孢子、叶状体和果孢子中光合碳同化关键酶的活性及其基因表达的差异，揭示不同世代光合碳同化途径转换的调控点，阐明坛紫菜光合碳同化与其生长发育的关系。本项目的完成，有利于了解从原核蓝藻到真核红藻的进化机制，同时，对坛紫菜的栽培实践有重要的指导意义。

本项目以我国重要的栽培海藻——紫菜为对象，系统分析其不同世代碳同化路径的异同。首先，对紫菜进行高通量测序，获得低覆盖全基因组草图；以此为参考数据，进行紫菜小RNA测序、转录组和表达谱分析，在条斑紫菜中获得14条miRNA，在坛紫菜中获得5条miRNA，其中只有1条miRNA两种紫菜共有，两种紫菜不同世代间分别只有1条miRNA共有，表明miRNA不仅有种间特异性，而且同种不同世代间也有很大差异，在紫菜世代转化中起调控作用。其次，获得了紫菜C4固碳路径相关的所有重要基因，其中有些在大型海藻中首次发现，如丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）等。这些基因均已在大肠杆菌中进行表达，并以其重组蛋白制备抗体标记胶体金，进行细胞定位分析。由于一些基因表达的重组蛋白抗体胶体金标记的效果不佳，我们制备了单抗，这些基因包括PPDK和不同类型的碳酸酐酶CA等。第三，以紫菜Calvin循环CO2固定的关键酶和限速酶Rubisco为对象，在转录、翻译及酶活等水平上系统比较分析其在不同世代中的表达，发现单倍配子体世代中Rubisco的含量和活性均高于二倍孢子体，表明Rubisco在不同世代碳同化途径中起重要作用。第四，对紫菜卡尔文循环的其它酶基因进行了比较研究，发现在转录、翻译以及酶活水平上核酮糖磷酸激酶（PRK）也是单倍叶状体高于二倍丝状体，解释了单倍配子体高Rubisco活性的底物RuBP的来源问题。同时，比较分析了Calvin循环的还原阶段其它酶如3-磷酸甘油酸激酶（PGK）等酶的活性，阐明了配子体中大量积累3-PG利于紫菜配子体高生物量的积累。进一步研究发现，紫菜配子体磷酸戊糖途径氧化阶段的酶G6PDH和6PGDH活性均高于孢子体，由此认为，紫菜不同世代的光合碳同化途径转换的调控点在于其核心代谢路径尤其是磷酸戊糖途径活性的差异。第五，通过GC-MAS检测紫菜不同世代中心碳代谢及其中间代谢物生成13C标记氨基酸量的差异，发现由3-PG生成的Ser、Gly的标记丰度与时间正相关，TCA代谢中间物生成的氨基酸如Glx，Thr，Pro等也与此类似，表明紫菜存在着C4途径。以上结果说明，紫菜丝状孢子体中确实存在PCK型C4固碳途径。本项目共发表SCI论文40篇，其中在藻类学权威杂志Journal of Phycology的7篇；培养博士研究生8名，硕士研究生18名。