Ghrelin在蒙古绵羊黄体形成和退化过程中作用的研究

黄体作为卵巢上主要功能单位之一，对维持哺乳动物正常生殖的作用至关重要，同时其周期性变化与能量代谢息息相关。而Ghrelin在调节能量平衡等多种生物学功能的积极作用，促使我们深入探讨Ghrelin是如何参与了黄体形成和退化。为此，我们以本地区特有的蒙古绵羊为研究对象，通过体外诱导卵泡壁颗粒细胞使其达到类黄体细胞的功能，通过添加外源Ghrelin上调和多种下调作用方式，采用ELISA、Real time RT-PCR、Western bolt、MTT法和钙离子测定等多种技术，拟系统探讨体外条件下Ghrelin与三种生殖激素的互作是如何介导黄体的形成，又是如何参与细胞凋亡，以阐明Ghrelin调控绵羊发情周期中黄体形成及退化两个重要过程中可能的作用机制。为进一步研究Ghrelin对其繁殖机能的影响提供必要的基础资料，并为寻求一种提高绵羊繁殖力的有效途径奠定基础。

Ghrelin(促生长激素释放肽)由28 个氨基酸组成的脑肠肽，是生长激素促分泌素受体(GHS)的天然配体。免疫组化结果显示卵泡内颗粒细胞Ghrelin的免疫活性及mRNA水平远弱于发情周期黄体细胞，且荧光染色表明卵丘颗粒细胞中亦表达Ghrelin。. Ghrelin mRNA与黄体周期变化呈正相关，MC4R mRNA表达与黄体周期变化呈负相关，Ghrelin/MC4R表达存在负调控影响黄体进程。免疫组化检测表明Ghrelin和MC4R在绵羊卵巢上呈广泛性表达，特别在卵泡内膜细胞呈强阳性表达，另在初级卵泡的颗粒细胞阳性信号较强。. 联合添加LH(2.5IU/ml)、FSH(2.5IU/ml)、E2(1ug/ mL)24h后，显著促进孕酮分泌(P<0.05)，初步建立了体外培养绵羊卵巢颗粒细胞向黄体细胞分化模型，黄体化标志基因StAR、CYP11均显著高于0h和24h实验对照组，而3β-HSD未见显著性变化，该变化与体内有、无黄体上的卵泡颗粒细胞一致。各处理均不同程度的抑制黄体标志基因的表达，功能基因BAX与黄体标志基因呈现一致变化，而对GHSR未体现作用。Ghrelin通过上调AMPK磷酸化，下调ERK磷酸化，并抑制UCP1影响黄体化进程。. PCMV-GFP-Ghrelin载体共转质粒转染绵羊颗粒细胞，构建Ghrelin-eGFP转染细胞系。转染后Ghrelin细胞在膜上表达，转染后细胞经Ghrelin染色后，成像后亦在细胞膜上表达，表达远低于转染后的GFP。. Ghrelin/KiSS1基因在卵母细胞、卵丘细胞及有腔卵泡内膜细胞均有表达。在各组别中KiSS1均显著高于Ghrelin的表达，有腔卵泡内膜细胞Ghrlein的表达高于卵母细胞和卵丘细胞；而KiSS1呈现卵母细胞高于有腔卵泡内膜细胞，腔卵泡内膜细胞，高于卵丘细胞。免疫组化显示原始卵泡(颗粒细胞和卵泡细胞)、次级卵泡(颗粒细胞和卵泡细胞、内膜细胞和外膜细胞)均共表达Ghrelin/KISS1，显示了卵泡发育过程积极作用。. 本研究结果表明Ghrelin与MC4R、KiSS1共同协调，通过过AMPK、ERK和UCP1，并与StAR、CYP11、StAR、BAX和CYP11共同调控黄体进程，为进一步研究激素在黄体形成和退化过程中的影响提供积极证据。