基于酵母展示的家蚕乙酰胆碱酯酶分子进化及其对有机磷农药分析特性研究

Acetylcholineseterase(AChE) is the key agent for organophorphorus pesticides(OPs) analysis by enzyme-inhibition method. However, AChE extracted from natural source has several disadvantages such as low content and poor sensitivity. Therefore, how to get AChE with high quality by recombinant technology has become the research hotspot in this field. In this project, with the aims to improve the sensitivity for OPs, enzyme stability and expression level, we intend to study on molecular evolution of Bombyx mori acetylcholineseterase(BmAChE) by yeast display technology. Based on the bioinformatics analysis, bioactive residues sites is determined and yeast display library is constructed. By panning, target AChE with high activity and stability is screen out. Through optimization of codons and expression condition, high express level is achieved. Finally, a rapid enzyme-inhibition analysis method for OPs will be established based on the recombinant AChE displayed by in Pichia pastoris. The results from our project will be meaningful for innovating novel enzyme resource used in enzyme-inhibition method for OPs analysis.

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是酶抑制法检测农药残留的核心试剂。但天然提取的AChE存在含量低、纯化困难、稳定性差等不足，因此，高性能的重组AChE制备成为研究学者关注的热点。本项目以家蚕乙酰胆碱酯酶为研究对象，在前期获得具有酵母表达活性的家蚕乙酰胆碱酯酶基因的基础上，以提高对有机磷农药反应灵敏度、稳定性，提高表面展示表达量为目标，通过生物信息学分析家蚕乙酰胆碱酯酶的活性位点区域，定向进化家蚕乙酰胆碱酯酶，利用酵母展示技术，构建重组乙酰胆碱酯酶毕赤酵母展示文库，筛选对有机磷农药高灵敏、高稳定的乙酰胆碱酯酶基因，替换其中主要稀有密码子，经过发酵表达优化，提高酵母表面展示表达量，同时实现重组乙酰胆碱酯酶的固定化，进而建立基于酵母展示重组乙酰胆碱酯酶的有机磷农药的分析方法。本研究成果将对于创新有机磷农药酶抑制检测方法新型酶制剂来源具有重要意义。

针对当前酶抑制检测农药残留中核心试剂乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）存在天然来源含量低、纯化困难、稳定性差等不足，项目以家蚕乙酰胆碱酯酶BmAChE为研究对象，以提高对有机磷农药反应灵敏度、稳定性，提高表面展示表达量为目标，通过 BmAChE 序列的密码子优化设计，确定替换 607 个碱基，CG 含量由原来的 44.89 %提高到 46.85 %。构建的重组载体 pPIC9K-bmace- opt- AGα1线性化后转化毕赤酵母 GS115，经证实，乙酰胆碱酯酶成功展示在毕赤酵母表面，且表达量相比优化前提高 2.5 倍。酶活按菌体重量计算达到 2280.02 U/g。另外，对酵母展示重组乙酰胆碱酯酶的有机磷农药分析特性。结果显示，毒扁豆碱溶液表面展示的 BmAChE 的抑制中浓度 IC50 为 3.24×10-8 mol/L。同时，测定6种有机磷农药对表面展示opt-BmAChE 的抑制活性。其中水胺硫磷和对硫磷的抑制效果最为明显，IC50 为分别1.02×10-6 和 0.99×10-6 mol/L。测定灭多威、涕灭威、西维因、呋喃丹、三羟基克百威等5种氨基甲酸酯农药对表面展示的opt-BmAChE 的抑制活性。IC50分别为1.27×10-7、1.91×10-7、2.32×10-8、5.83×10-9 、2.99×10-8mol/L。以冷冻干燥的固体酶制剂，制成农药速测产品，与商业酶制剂相比，结果显示表面展示的重组BmAChE对有机磷类农药的敏感度明显高于商业酶。对该酶的生物信息研究发现，家蚕乙酰胆碱酯酶的丝氨酸活性中心FGESAG序列高度保守，通过同源建模，得到8个模型，进而对预测模型的质量与合理性进行评估。将预测模型与5种有机磷和5种氨基甲酸酯农药的在autodock软件中进行分子对接。结合实验结果发现，三种预测模型的活性中心峡谷瓶颈处的两个关键氨基酸MET182和TYR398的形态有所区别，且推测，AChE与配体的结合是一个动态的过程，所模建的三种模型分别模拟了整个动态过程中的三种不同状态，农药开始进入AChE时（model4），占据了活性中心峡谷，产生的空间位阻阻止了底物乙酰胆碱的进入，从而立刻导致催化抑制。