基于结构的人免疫缺陷病毒衣壳组装机理和功能表位的研究

It is evident that HIV-1 capsid is made of dimeric,pentameric and hexameric CA blocks. Otherwise, how the capsid assemble from intermedia components? what is functional epitope present in assembly procedure? These puzzles remain unclear, which is hot-spot in HIV research art. Supported by previous NSFC project, we sovle the crystal structure of CA dimer derived from an HIV native muatation isolate BMJ4. The structure demonstrates a unprecedented dimer mediated by Cys177 disulfide bond. The HIV viron harbours these new dimeric form CA proteins if a.a.177 is Cys, which may provides a unique opportunity to trap HIV-1 p24 structure at a novel shoulder-to-shoulder dimer architecture. The dimeric linkage may serve for generation of HIV capsid from known pentamer and hexamer. Based on these findings,we focus on the effect of Cys177 to modulate the propagation and infection ability of HIV viron or pseudo-virion using matation on HIV proviral plasmid. Furthmore, permutation of dimeric, pentameric and hexameric disulfide introduction may generate some HIV capsid morphy assemble native capsid architecture, which might elucide in deep assembly mechanism of HIV shell.Using our paramount anti-CA mAb, it is possible to identify some functional epitopes related to HIV capsid assembly. The structure of functional CA dimer, HIV capsid or in complex with mAb Fab would be sovled by X-ray crystollography or cryo-EM 3D reconstruction. The outcome in present study is expected to bring insight into HIV research based on CA strcture and aimed to therapeutic or vaccine design purpose.

已证明HIV-1的衣壳是由衣壳蛋白（CA）的二聚体、五聚体和六聚体等基本结构单位组装而成，但衣壳如何组装以及组装过程存在怎样的功能表位等问题仍悬而未决，基于CA蛋白的靶点研究成为HIV的研究热点之一。在上期国家自然科学基金资助下我们获得一种天然HIV突变株CA的独特二聚体晶体结构，是由Cys177相互形成二硫键介导，功能研究显示该二聚体存在于病毒粒子中，可能锁住了CA蛋白特殊的二聚体构象，为CA五聚体和六聚体进一步形成HIV衣壳提供了新的连接方式。本研究拟在此基础上进一步研究Cys177位点对病毒复制和感染能力的影响，设计多级二硫键的CA蛋白，研究HIV衣壳的组装机理；构建突变HIV假病毒/病毒，利用已有的单抗盘检测表位变化，从而鉴定功能表位，使用X-ray晶体衍射和低温电镜结构重建方法解析CA蛋白及免疫复合物结构，以期为基于CA的HIV研究（如抗病毒治疗、疫苗设计等）提供结构信息和思路。

本课题在已获得的由Cys177相互形成二硫键介导的一种天然HIV突变株CA的独特二聚体晶体结构的基础上，进一步研究HIV衣壳的组装机理，为基于CA的HIV研究（如抗病毒治疗、疫苗设计等）提供结构信息和思路。申请书的研究内容包括：（1）基于CA蛋白Cys177的病毒株改造和感染能力分析；（2）多级二硫键的CA蛋白表达和聚体形式分析；（3）多级二硫键CA蛋白突变体的表位谱分析；（4）多级二硫键CA蛋白及抗原抗体晶体结构的解析；（5）在HIV假病毒和真病毒进行低温电镜三维结构解析；（6）HIV假病毒和真病毒与细胞相互作用的细胞断层分析。我们在预定的研究内容和技术路线的基础上开展了相应研究，取得了相应的进展。.结题时，本课题使用Cryo-EM首次解析了CA突变体蛋白CA-N21C/A22C体外组装形成的T=4颗粒结构，由12个CA五聚体和30个六聚体形成的二十面体结构，同时，我们还利用CA-N21C/A22C为载体用于展示HIV Env蛋白的V3 loop区，产生的嵌合蛋白免疫小鼠可产生交叉中和抗体，为后续深入探究基于CA的免疫原研究奠定基础。取得了发表SCI论文4篇，非SCI论文2篇，中文核心期刊1篇，培养博士研究生2名，硕士研究生4名。希望国家基金委能够继续支持和资助我们的研究工作。