双顺反子病毒载体pLenti-TfR-NRG1转染自体内皮祖细胞移植治疗急性心梗的MR活体分子成像研究

Endothelial Progenitor Cells (EPCs) and Exogenous vascular growth factor (neuregulin1, NRG1) mediated therapeutic angiogenesis is now the new direction for treatment of acute myoinfarction by stem cells transplantation. However, the dynamic monitor and therapeutic effects evaluation remains a problem in mechanism study. In this project, both NRG1 and TfR （transferrin receptor）report gene would be colonized into dicistronic lentiviral vector to construct a pLenti-TfR-NRG1 vector. The Autologous progenitor cells of miniature pig would be transfected by the vector and introduced to the infarct area of acute myoinfarction animal model by coronary artery interventions. After introvenous injection of specific molecular probe Tf-MION(transferrin-monocrystalline iron oxide nanoparticles), the heart area of the pig would be scanned under MR system. The Tf-MION molecular imaging would help to monitor TfR expession, track the distribution of survival stem cells in vivo. At the same time, NRG1 expression would be inspected to examine the impacts to survival stem cells and transplant microenvironment. Oue team aims to set up MR gene imaging method of stem cells with NRG1 gene and TfR report gene, study the molecular imaging features, investigate the potencial function of NRG1 to acute myocardial infarct. These works would provide solid experimental fundation for stem cells transplant in treatment of acute myocardial infarct.

以内皮祖细胞（EPCs）联合外源性促血管生长基因（神经调节蛋白1，NRG1)介导的"治疗性血管新生"是目前干细胞移植治疗急性心梗（AMI）的新方向，但如何动态监测并评价疗效是治疗机制研究的难题。本课题预构建含治疗基因NRG1和报告基因TfR（转铁蛋白受体）的双顺反子慢病毒载体(pLenti-TfR-NRG1)；转染小型猪自体EPCs；冠脉介入法移植入AMI模型心梗区；静脉注入特异性结合TfR受体的分子探针Tf-MION（转铁蛋白单晶氧化铁纳米颗粒)，进行MR扫描；通过Tf-MION显像动态监测TfR的表达，示踪移植干细胞的存活与分布；同时通过检测NRG1在靶区表达，分析其对干细胞存活和移植微环境的影响。本课题建立同时携带NRG1基因和TfR报告基因的移植干细胞MR基因成像方法，研究其分子影像特征，探讨NRG1对干细胞移植疗效的作用机制，为临床开展急性心梗的干细胞移植基因治疗积累实验基础。

本课题的研究目的是建立一种能够在活体内观察移植细胞携带治疗基因表达情况的MRI方法，探讨分子探针在活体内的代谢规律和成像方法。在研究工作中我们成功的分离并培养了内皮祖细胞（EPCs），并利用慢病毒载体成功的将转铁蛋白受体 (TFR)和血管生长基因（神经调节蛋白1，NRG1)导入移植细胞中，随后通过MR的分子影像学分析，初步证实了TF-TFR系统在治疗基因活体成像研究中的可行性。根据前期的实验设计本课题整体上分为4个阶段：第一阶段的研究中我们的重点工作是制备TF-MION分子探针，分析其剂量、以及在MRI中的使用；第二阶段的研究工作中，我们成功构建了双顺反子慢病毒载体pLenti-TFR-NRG1，分别通过测序和酶切鉴定证实载体构建成功。第三阶段我们分离培养内皮祖细胞（EPCs），并在形态学、免疫学等多个角度证实了细胞的特性，同时将慢病毒表达载体转染293细胞后，成功获得了高滴度的慢病毒，感染EPCs后，分别在转录和翻译水平检测TFR和NRG1的表达，证实在感染细胞中可以实现两种蛋白的同时表达。第四阶段将感染细胞移植实验动物模型后MRI可以在活体观察到移植细胞的存活和分布。通过离体组织的分析获得了各种形态学指标的数据，以及基因水平的各项指标的检测。为进一步的研究和应用奠定了基础。在3年的研究工作中，我们认真的分析了实验计划，对各个阶段的工作进行了合理的分配，同时通过联合培养提高了研究生的实验操作技能，在3年的研究工作中，我们发表SCI论文3篇。完成了课题的研究计划和工作目标。