基于液相色谱-串联质谱筛查珠蛋白生成障碍性贫血新方法的建立与应用研究

Globin synthesis aplastic anemia is one of the most common genetic disease encountered in provinces and cities of south China and causes great harm to life thriving. Conventional laboratory tests with the defects of low sensitivity and specificity, poor repeatability, high costs and tedious operation are not suitable for disease screening. Early diagnosis and prevention through prenatal diagnosis and newborn screening is an important measure to reduce the incidence of the disease, however, there is no such screening method. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) can detect the mass/charge ratio (M/Z) and response intensity of sample ions to achieve qualitative or quantitative analysis with using of isotope internal standards. LC-MS/MS was proved to be a specific, sensitive, high-throughput and low cost method, which is very applicable for disease screening. Based on our early success on the detection of some hemoglobin variants and clinical practices of inherited metabolic disorders screening using LC-MS/MS, This study is intend to found a novel method, which is simple, maneuverable,low cost but high-throughput for detecting globin synthesis aplastic anemia, and to explore the clinical application of dried blood filter card samples for screening of the disease. The aim of this project is to expand the conditions checked by prenatal screening and newborn screening programs in China, and achieve the ultimate goal of reducing birth defects of globin synthesis aplastic anemia and improve the overall quality of population.

珠蛋白生成障碍性贫血是我国南方各省市最常见的遗传病之一，危害极大。该病的传统实验室检测方法存在敏感性与特异性不够、重复性差、检测成本高及操作繁琐等不足，不宜作筛查手段广泛使用。然而通过一定的筛查方法，早期发现病及时预防，对于降低该病发病率和改善患者预后有重要意义。目前尚缺少这样的筛查方法。LC-MS/MS具有特异、灵敏、高通量、检测费用低等优点，在游离氨基酸的检测方面已经很成熟，比如新生儿遗传代谢病筛查。本研究拟探讨LC-MS/MS技术检测疾病相关蛋白质及其多肽的可行性，通过筛选疾病相关蛋白的标志物，利用疾病阳性标本和同位素内标做质量控制，实现对疾病相关蛋白或多肽的定性、定量分析，并最终对受检人患病与否的作出预测。我们在前期利用LC-MS/MS进行遗传代谢病筛查和成功检测部分血红蛋白变异的基础上，拟建立基于该技术筛查珠蛋白生成障碍性贫血的新方法，探讨利用干血滤纸片样本进行该病筛查的临床应用，以期建立一种前处理简便、低成本、高通量的筛查新方法，拓宽遗传病筛查病种，达到减少珠蛋白生成障碍性贫血出生缺陷和提高人口整体素质的最终目的。

背景： 珠蛋白合成障碍性贫血是我国南方各省市最常见的遗传病之一，危害极大。该病的传统实验室检测方法存在敏感性与特异性不够、重复性差、检测成本高及操作繁琐等不足，不宜作筛查手段广泛使用。然而通过产前诊断和新生儿筛查，早期发现与及时预防是降低该病发病率的重要手段。目前尚缺少这样的筛查方法。液相色谱－串联质谱可通过检测样品离子的质荷比及响应强度信息，结合运用同位素内标，可实现对检测物质的定性、定量分析，具有特异、灵敏、高通量、检测费用低等优点，非常适宜于疾病筛查。.研究内容： 本研究拟建立基于串联质谱技术筛查珠蛋白合成障碍性贫血的新方法，探讨利用干血滤纸片样本进行该病筛查的可行性。主要研究内容有：.1. 适宜规模化筛查的样本制备方法及样本收集：（1）α和β患者；（2）未经确诊的潜在患者；（3）正常对照组标本。.2．标本实验前处理及分析物萃取方法。.3．肽段择优与质谱参数优化。.4．LC-MS/MS进样方法的构建，诊断指标设计。.5．患者标本及正常对照的质谱分析，数据统计，诊断指标参考区间确定。.6．方法学评价，完成实验方法的稳定性评价及方法间的比对。.重要结果： 完成干血滤纸片样本收集方法的建立、实验前处理及分析物萃取方法的建立和优化；完成串联质谱筛查珠蛋白合成障碍性贫血新方法的建立及应用评价。主要数据如下：.1..新方法用于珠蛋白合成障碍性贫血，特别是β-珠蛋白合成障碍性贫血检测，敏感性及特异性均＞90%。.2..新方法检测样本采样时间小于60秒/例，批内及批间变异小于10%。.3..没有明显的携带污染、基质效应，保存良好的样本可稳定至少2个月。.4..完成1200例病人样本及500例正常样本的分析及临床比对。.科学意义： LC-MS/MS用于珠蛋白合成障碍性贫血的筛查，是一种前处理简便、低成本、高通量的筛查新方法，拓宽产前筛查和儿童群体筛查的病种，可运用于疾病的三级预防体系，减少珠蛋白合成障碍性贫血出生缺陷的发生，达到提高出生人口质量的目的。