丝素蛋白自组装纳米微球修饰膀胱脱细胞基质复合脂肪干细胞促进膀胱再生的实验研究

Tissue engineering is the most promising physiologic repair technology for bladder reconstruction. How to promote regeneration of bladder with large area of deficiencies is a difficulty and hotspot of current tissue engineering for bladder reconstruction, while early rapid vascularization is the key element of regeneration of bladder tissue with large area of deficiencies. VEGF is recognized as the inducing factor of angiogenesis and vasopermeability. It can promote regeneration of bladder tissue by use of continuous slow release of VEGF based on Nanotechnology and by combining capability of multilineage differentiation and characteristics of secreting various growth factors of adipose-derived stem cells and can further achieve a good repair effect. This study began with promotion of graft blood supply reconstruction and used protein self-assembly to prepare fibroin - VEGF nanometer saccule and explored parameters of nanometer saccule necessary for promoting regeneration of bladder tissue, prepared fibroin nanometer saccule - VEGF-BAMG composite scaffold. The animal model of bladder with large area of deficiencies after subtotal resection of canine bladder was established and used to verify the effectiveness of adipose-derived stem cells seeded fibroin nanometer saccule - VEGF-BAMG composite scaffold of reconstructing bladder and disclose the mechanism of slow release of fibroin nanometer saccule carrying VEGF and promotion of bladder neovascularization for seeking new ideal substitute materials of bladder replacement.

组织工程是进行膀胱重建最具有前景的生理性修复技术。如何促进大面积膀胱缺损的组织再生是目前组织工程技术进行膀胱重建的难点和热点。而早期快速的血管化则是大面积膀胱缺损组织再生的关键要素。VEGF是公认的血管形成和血管通透性诱导因子，通过纳米技术对VEGF的持续缓慢释放结合脂肪干细胞多向分化能力和分泌多种生长因子的特点，可以促进膀胱组织的再生，从而达到良好的修复效果。本研究拟从促进移植物血供重建出发，采用蛋白自组装制备丝素蛋白-VEGF纳米微球，探索促进膀胱组织再生所需的纳米微球参数，制备丝素蛋白纳米微球-VEGF-BAMG复合支架；通过建立犬膀胱次全切除后的膀胱大面积缺损的动物模型，验证脂肪干细胞接种丝素蛋白纳米微球-VEGF-BAMG复合支架重建膀胱的效果，揭示携载VEGF的丝素蛋白纳米微球缓释及促进膀胱新生血管形成的机制，为膀胱替代寻找新的理想的替代材料。

组织工程是进行膀胱重建能避免传统的重建方法带来的诸多并发症，是一种新型有效的方法。如何促进大面积膀胱缺损的组织再生是目前组织工程技术进行膀胱重建的难点和热点。而早期快速的血管化则是大面积膀胱缺损组织再生的关键要素。VEGF是公认的血管形成和血管通透性诱导因子，通过纳米技术对VEGF的持续缓慢释放结合脂肪干细胞多向分化能力和分泌多种生长因子的特点，可以促进膀胱组织的再生，从而达到良好的修复效果。本研究拟从促进移植物血供重建出发，采用蛋白自组装制备丝素蛋白-VEGF纳米微球，探索促进膀胱组织再生所需的纳米微球参数，制备丝素蛋白纳米微球-VEGF-BAMG复合支架；通过建立兔膀胱次全切除后的膀胱大面积缺损的动物模型，验证脂肪干细胞接种丝素蛋白纳米微球-VEGF-BAMG复合支架重建膀胱的效果，揭示携载VEGF的丝素蛋白纳米微球缓释及促进膀胱新生血管形成的机制，为膀胱替代寻找新的理想的替代材料。本研究中，利用丝素蛋白的自组装的特性，利用乙醇和冷冻的协同作用下，已成功制备出包裹VEGF的直径均一100nm左右的丝素蛋白纳米微球，运用ELASA检测VEGF的体外释放曲线显示释放高峰为72小时，结合移植物新生血管再生的时间，复合移植物再生血管的需要。我们采用含0.1%的Triton X-100及0.15%0氨水的脱细胞液对膀胱脱细胞处理后，得到富含胶原纤维，无细胞成分的完整的脱细胞基质，将纳米微球与支架进行交联。体外培养出实验动物自身脂肪干细胞，扩增后复合于支架表面，HE染色见细胞与支架复合生长良好。复合支架回植修复兔膀胱次全切除后的膀胱缺损为实验组(III 组），对照组分别为单纯支架组（I)和单纯支架复合ADSCs组(II组)。24周后，单纯支架修复组膀胱容量明显减小，HE染色仅可见重建膀胱壁上皮再生，再生平滑肌结构紊乱，未见明显新生血管。丝素蛋白纳米微球-VEGF-BAMG复合支架重建膀胱组，可见上皮及平滑肌再生，血管再生不良。脂肪干细胞复合丝素蛋白纳米微球-VEGF-BAMG支架重建膀胱可见完整的复层上皮细胞及正常的平滑肌组织再生，接近于正常膀胱，同时可见大量新生血管再生。通过该上述方法，我们较好的解决了较大面积膀胱重建移植物的血供问题，避免其坏死，挛缩，从而达到较好的重建效果。同时为解决其他器官移植物血供重建提供一种新的解决方法。