长链非编码RNA Arid2-IR在CRP抑制急性肾损伤肾小管上皮细胞增殖中的作用及机制

Our previous study suggests that one of the major means by which CRP promotes AKI is by directly interacting with TECs to induce Smad3-dependent p27-driven inhibition of the CDK2/cyclin E pathway that is required for the G1/S transition. Targeting Smad3 may represent a novel and effective therapy for AKI. In recent years, it is shown that ncRNA (non-coding RNA), such as microRNA, snoRNA, lncRNA, may play a critical role in the development of diseases. TGF-β/Smad3-related ncRNAs may be the therapeutic targets for renal diseases. Arid2-IR was a Smad3-associated lncRNA as a Smad3 binding site was found in the promoter region of Arid2-IR and deletion of Smad3 abolished upregulation of Arid2-IR in the diseased kidney. So we hypothesize that lncRNA Arid2-IR may play an important role in CRP promotion of AKI via a Smad3-dependent mechanism. We tested this hypothesis in vivo using C57BL/6 mice, CRP Tg mice and in vitro using cultured TECs.

前期研究中我们发现CRP通过激活TGF-β/Smad3信号通路上调p27表达，抑制细胞周期，抑制AKI肾小管损伤增殖修复，促进AKI肾损伤，针对Smad3可提供AKI的新的治疗靶点；而近年研究发现，lncRNA Arid2-IR在肾脏的损伤中TGF-β/Smad3介导肾脏炎症及纤维化发挥着重要的作用，Arid2-IR可促进肾脏损伤时的炎症反应。由此我们提出研究假设：lncRNA Arid2-IR参与急性肾损伤发生，Arid2-IR在CRP调节Smad3/p27/CDK2-cyclinE抑制肾小管上皮细胞增殖的过程中可能发挥作用。本项目拟从以下方面开展研究：建立缺血再灌注急性肾损伤模型，观察急性肾损伤对Arid2-IR表达的影响；通过CRP转基因小鼠建立缺血再灌注急性肾损伤模型观察CRP对急性肾损伤中Arid2-IR表达的影响及观察沉默Arid2-IR对肾小管上皮细胞增殖、再生的影响。

急性肾损伤是一种肾功能减退的常见的临床综合征，顺铂是一种常见的肾毒性药物，主要用于治疗多种实体肿瘤，由于顺铂肾毒性等副作用，常常限制其在临床中的使用。因此，探索顺铂导致的急性肾损伤的发病机制，寻找治疗的新靶点具有重要意义。研究内容：1、通过腹腔注射顺铂建立小鼠AKI 模型；收集小鼠血标本检测血肌酐和尿素氮水平，肾脏肾标本进行PAS、Tunel、Brdu染色，免疫组化检测PCNA变化；不同浓度的顺铂刺激肾小管上皮细胞24小时后，通过CCK8检测细胞活性，Western blot检测细胞凋亡蛋白水平；检测Smad3磷酸化水平变化。2、通过Real-time PCR检测顺铂诱导的急性肾损伤和正常小鼠肾组织中lncRNA Arid2-IR表达水平变化，使用原位杂交技术检测Arid2-IR在细胞的定位情况；腹腔注射Smad3抑制剂SIS3 通过Real-time PCR观察小鼠肾组织中lncRNA Arid2-IR表达水平变化。3、体外培养mTECs，利用慢病毒转染的方式过表达lncRNA Arid2-IR后，加或不加顺铂刺激，通过CCK8检测细胞活性，Wb检测细胞凋亡、细胞周期相关蛋白水平。通过RNA pull down和质谱分析筛选出与lncRNA Arid2-IR结合的蛋白分子，并利用GO和KEGG 通路进行分析和Wb进行验证。重要结果：1、小鼠腹腔注射顺铂72小时后，血肌酐和尿素氮水平升高，肾小管上皮细胞肿胀、空泡样变和坏死，细胞凋亡和增殖增加；顺铂刺激mTECs后，呈浓度依赖性降低细胞活力，导致细胞凋亡增加；体内外实验结果均显示，顺铂刺激后，Smad3磷酸化水平较正常对照组均升高；使用Smad3抑制剂后可以显著改善顺铂导致的小鼠肾功能下降、肾小管损伤肾小管上皮细胞凋亡，促进肾小管增殖修复。2、小鼠腹腔注射顺铂72小时后，肾组织lncRNA Arid2-IR水平下降；顺铂刺激mTECs后，呈浓度和时间依赖性降低肾小管上皮细胞lncRNA Arid2-IR水平。3、过表达lncRNA Arid2-IR后，可以增加肾小管上皮细胞活性；减少Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达；通过RNA pull down和质谱分析发现有181个可以与lncRNA Arid2-IR潜在结合的蛋白分子，检测到lncRNA Arid2-IR可通过结合TFRC蛋白对细胞周期调控。