基于神经内分泌轴及Ras/Raf/MEK/ERK通路的围绝经期综合征肝郁证形成的分子机制研究

The formation of Syndrome results from multiple factors. Our previous studies showed that, liver-qi stagnation is the major pathogenesis of perimenopausal period syndrome (PPS), and runs through the whole process of disease. But the relationship between formation of PPS liver-qi stagnation syndrome and natural aging, emotional stimuli remains unclear. First of all, We use the model of natural aging PPS rats, natural aging rat combining with bound feeding, The rats of treated groups were intragastric administered with herbal formula Chaihu-shugan-san (CHSGS) for 3 weeks.We observe the changes of hormone levels and ultrastructure of HPA and HPO axis, and animal behavior, analyse the relationship between formation of liver-qi stagnation syndrome in perimenopausal period syndrome and the natural aging, emotional stimuli. Secondly, Based on the changes of related genes and protein in rat hippocampus Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway, we explore the molecular mechanism of formation of liver-qi stagnation syndrome in perimenopausal period syndrome. Thirdly,We establish the cell system of hippocampal neurons in vitro, use the real-time pcr technique to detect the genes expression of Ras/Raf/MEK/ERK pathway after treated with CHSGS or CHSGS combine with specific inhibitors of pathway.This study is expected to further enrich the pathogenesis theory of liver-qi stagnation syndrome,to provide the experimental basis for theory of PPS prevention and treatment from liver.

证的形成是多因素作用的结果。本课题组前期研究表明，肝郁是围绝经期综合征（PPS）的主要病机，并贯穿于疾病的整个过程，但是，PPS肝郁证的形成机制及其与自然衰老、情志刺激的关系尚未阐明。本课题（1）采用自然衰老PPS大鼠模型及自然衰老+慢性束缚所致的PPS肝郁证大鼠模型，以柴胡疏肝散（CHSGS）验证，从动物行为、HPA轴及HPO轴的不同层面激素水平及超微结构的改变，探讨PPS肝郁证的形成与自然衰老、情志刺激的关系。（2）从大鼠海马Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关基因、蛋白的表达变化，分析PPS肝郁证形成的分子生物学机制及CHSGS的干预作用；（3）建立体外海马神经元细胞体系，采用定量PCR技术检测CHSGS、CHSGS +抑制剂处理后Ras/Raf/MEK/ERK通路相关基因表达变化，进一步体外验证。本研究将进一步丰富PPS肝郁证的病机理论，为PPS的预防及从肝论治提供实验依据。

围绝经期综合征是由于卵巢功能衰退, 体内雌激素水平降低导致神经-内分泌系统失调, 引起植物神经功能紊乱和精神神经症状等一系列临床症候群。团队前期研究表明，肝郁是围绝经期综合征的重要病机。为探讨肝郁证形成的机制，提出科学假说：肝郁证的形成是衰老及情志刺激等共同导致的,海马中Ras-Raf-MEK-ERK 信号通路的失衡是围绝经期综合征肝郁证形成的重要分子机制。.本课题采用自然衰老的 PMS 大鼠模型及自然衰老+慢性束缚所致的 PMS 肝郁证大鼠模型。结果（1）与PMS模型组相比，PMS柴胡组行为学得分升高，但差异并不显著；与PMS肝郁组相比，PPS肝郁柴胡组水平运动、垂直运动得分均显著性提高。（2）与正常对照组相比，PMS模型组、PMS肝郁组E2水平显著降低；PMS柴胡组及PMS肝郁柴胡组雌二醇水平无显著提高。与正常对照组相比，PMS模型组、PMS肝郁证模型组LH、FSH水平显著提高；PMS柴胡组及PMS肝郁柴胡组大鼠外周血血清的FSH水平均显著下降。（3）与正常对照组相比，PMS模型组、PMS肝郁组血清GnRH、ACTH、CRH显著性升高，PMS柴胡组GnRH显著下降，PMS肝郁证柴胡疏肝散组GnRH、CRH均显著下降。（4）PMS肝郁模型组Mek2及Erk2 mRNA 表达降低；PMS肝郁柴胡组Mek2及Erk2 mRNA 表达提高。蛋白质印迹技术结果表明，raf1，MEK1/2，ERK1/2总蛋白在3组大鼠海马中没有显著性差异；p-raf1，p-MEK1/2，p-ERK1/2 三种磷酸化蛋白在肝郁模型组中表达均下调，柴胡疏肝散给药后，蛋白表达水平显著性提高。.结合文献分析，课题组认为，衰老、情志刺激（束缚）等均对大鼠神经内分泌轴、动物行为均产生影响，Raf/MEK/ERK 信号通路在PMS肝郁证大鼠海马受到抑制，而柴胡疏肝散治疗可激活这个信号通路，表明Raf/MEK/ERK 信号通路失衡可能是围绝经期综合征肝郁证的重要分子机制之一。本课题通过PMS肝郁证形成的研究，有利于丰富PMS肝郁证的病机理论,为围绝经期综合证肝郁证的实质研究提供参考，对中医证的现代化研究具有重要参考意义。