整联蛋白和催乳素调控奶牛乳腺上皮细胞分化的信号串话机制

Integrin heterodimers as transmembrane receptors for extracellular matrix (ECM) on cell surface mediate cell-ECM adhesion and is involved in cell fate determination. In addition, the effects of hormones or growth factors as temporal signals on mammary development and lactation also depend on special spatial signals provided by cell-ECM adhesion complexes(adhesomes). Therefore, sustained milk protein expression is possible associated with crosstalk signaling between integrins and lactogen hormones/growth factors receptors. We aim at alpha6, beta1 and beta4 integrin subunits expressed in bovine mammary epithelial cells which are associated with cell proliferation, survival, apoptosis and differentiation, then their distribution and expression level will be detected in vivo. In vitro, cells will be cultured in a Transwell chamber with different substrates including lamnin which is key basemembrane component, because such a microenvironment which is highly reminiscent of in vivo mammary alveoli is required by adhesomes, apical-basal polarity and sectory activation. In each case, blocked integrins activity by function blocking antibody or decreased downstream effectors (ILK/Rac1 and FAK) mRNA expression by RNAi will be representative of disturbed integrin signaling, moreover the potential partner of integrins in adhesomes will be identified and found out by the combination of Co-immunoprecipitation, Western blotting and mass spectrum. It is expected that our research data may reveal the effects of integrins gene expression, heterodimers activity and signaling complexes on secretory differentiation with laminin substrate, and the crosstalk signaling between special integrins and prolactin receptors is resquired by sustained milk protein synthesis in cow mammary epithelial cells.

整联蛋白以异二聚体形式介导细胞内外的信号转导，参与细胞-细胞外基质黏附过程，催乳激素和生长因子对泌乳分化的调控依赖于这种细胞-细胞外基质相互作用，但整联蛋白调控奶牛泌乳分化的信号机制尚不清楚。体内基膜主要成分层粘连蛋白与乳腺上皮细胞分化密切相关，而奶牛乳腺上皮细胞表达的α6、β1和β4整联蛋白亚基能形成α6β1和α6β4（层粘连蛋白的细胞表面受体）。因此，本研究以层粘连蛋白等基膜成分为底物，使用分化培养液（含催乳素等成分）在Transwell小室中模拟生理微环境，诱导细胞的顶-基底极性和分泌性分化。免疫共沉淀、蛋白免疫印迹和质谱联用分析整联蛋白在奶牛乳腺上皮细胞的表达定位以及异二聚体形式，及其与催乳素受体的蛋白质相互作用，利用功能阻断抗体和RNAi调控整联蛋白，以及胞内信号分子FAK、ILK和Rac1表达，揭示整联蛋白介导细胞外基质作用调控泌乳的信号途径及其与催乳素信号之间的串话方式。

本项目借鉴信号转导研究领域的新热点，致力于揭示奶牛乳蛋白表达合成过程中未被发现的作用方式，阐明泌乳诱导过程中多信号途径多作用靶点的串话网络调控。.通过研究分析非基膜成分BSA，基膜类似物Matrigel和基膜主要成分层粘连蛋白（LN）对于奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）泌乳途径重要分子表达和活性，以及泌乳能力的影响，验证了LN是对于BMECs泌乳十分重要的关键性细胞外基质（ECM）。通过LN与牛生长激素、胰岛素样生长因子-1、催乳素联合调控泌乳分化的实验设计，阐明了LN作为空间信号并不能像可溶性因子能够跨膜转运进入细胞内激活信号途径，它通过细胞表面受体整联蛋白来构建细胞-ECM锚定平台，募集信号分子，整联蛋白形成蛋白质复合物使各成分之间产生相互作用，协同促进泌乳信号途径的稳定激活。本项目实验结果也为验证这些设想提供了有力证据，LN或整联蛋白不直接诱导泌乳分化，缺少HIP等刺激因素时，它显得像BSA一样无用，但是一旦正向刺激激活泌乳途径，它就会显现出很强的协同促乳能力，有时候甚至超过全能的Matrigel，显著地提升各种激素/生长因子的促乳效果，增强PRL/STAT5和AKT1/mTOR活性，而它又可以广泛抑制负调控因子的表达，为泌乳正调控创造有利条件。功能阻断型抗体抑制整联蛋白β1活性后也会导致其下游分子ILK表达减少，LN失去协同促乳作用，显然整联蛋白β1负责介导LN的这部分作用。整联蛋白β1与催乳素受体（PRLR）共定位基底侧细胞膜，催乳素诱导泌乳分化时，其表达上调又与PRLR表达上调同步，更重要的是免疫共沉淀与质谱联合分析表明它们形成了复合物，能够发生蛋白质相互作用。这可能是LN通过激活整联蛋白β1信号途径协同促进PRL/STAT5活性的一种作用方式。质谱分析获得信息显示协助促乳的β1亚基来自两种检测到的异二聚体α3β1和α3β1，也可能是其中一种。.总之，LN是在泌乳正向调控和反向调控都协同促乳的关键性细胞外基质，通过激活整联蛋白β1信号途径实现功能。整联蛋白β1与PRLR存在蛋白质相互作用，实现了ECM信号途径与PRL/STAT5的串话。