外泌体在Niche细胞调控角膜上皮再生中的作用及其机制研究

Corneal limbal niche plays an important role in the regulation of corneal limbal stem cells and epithelial regeneration. We have found that niche cells can promote proliferation of LSCs and maintain their undifferentiated states. Although researchers have found that Wnt signaling pathway plays an important role in regulating LSCs, the concrete mechanism is not clear yet. Exosome is an important way for niche cells regulating stem cells. In our previous experiments we have discovered that Wnt5 was contained in limbal niche cells derived exosomes, and these exosomes promoted β-catenin nuclear translocation and activity to enhance proliferation of LSCs. Based on the important role of Wnt signaling pathway in regulating LSCs, we speculate that limbal niche cells may regulate the LSCs through secreting Wnt rich exosomes. Therefore, this study intends to verify the effects of niche cell-derived exosomes on the regulation of LSCs and the regeneration of corneal epithelium through in vitro cell experiments and in vivo animal experiments, and to further explore its possible molecular mechanisms. The purpose of this study is to enrich the knowledge of corneal wound healing theory and provide the novel targets for the therapy of corneal epithelial dysfunction.

角膜缘niche对调控角膜缘干细胞与上皮再生方面起着重要作用。我们前期研究证明了角膜缘niche细胞可以促进角膜缘干细胞（LSCs）增殖并保持其未分化特性，国外研究发现角膜缘niche可以通过Wnt信号通路等途径调控LSCs特性，但具体的调控方式和作用机制尚不完全清楚。外泌体是近年来发现的niche细胞调控干细胞的重要途径。我们预实验发现角膜缘niche细胞来源外泌体中富含Wnt成分，并促进Wnt信号通路关键分子β-catenin的核易位和LSCs的增殖能力。基于Wnt信号通路在调控角膜缘干细胞特性中的重要作用，我们推测niche细胞可能通过分泌富含Wnt成分的外泌体调控LSCs的增殖和分化。因此，本课题拟通过体外细胞实验、体内动物实验验证niche细胞来源外泌体对LSCs特性调控和角膜上皮再生的作用，并深入探讨其可能的分子机制，为角膜上皮功能障碍的治疗提供理论基础和科学依据。

角膜缘干细胞是维持正常眼表功能的关键，其缺乏将导致致盲性眼病。角膜缘干细胞存在于角膜缘niche细胞（LNC）构成的微环境中，前期研究表明，LNCs可以通过Wnt信号通路等途径调控角膜缘干细胞特性，但具体的调控方式和作用机制尚不明确。外泌体是近年来发现的niche细胞调控干细胞的重要途径。我们预实验发现角膜缘niche细胞来源外泌体中富含Wnt成分，基于Wnt信号通路在调控角膜缘干细胞特性中的重要作用，我们推测niche细胞可能通过分泌富含Wnt成分的外泌体调控角膜缘干细胞的增殖和分化。. 本课题进行了以下研究：（1）体外扩增角膜缘niche细胞，通过干细胞标记物表达进行鉴定。将扩增的niche细胞行3D培养，模拟天然的角膜缘niche微环境，收集细胞上清液，通过超速离心法分离、纯化角膜缘niche细胞外泌体，用透射电镜观察提取的外泌体，通过免疫印迹法鉴定外泌体标记物及Wnt蛋白的表达。（2）观察外泌体对角膜缘干细胞增殖的细胞实验。进一步行动物实验，通过建立小鼠角膜上皮损伤和干眼病小鼠动物模型，研究角膜缘niche细胞外泌体对角膜上皮损伤小鼠及干眼病小鼠角膜修复的影响。（3）通过免疫荧光染色法观察不同浓度niche细胞外泌体作用角膜缘干细胞后β-catenin蛋白活化在细胞核内聚集情况。. 本研究探索并建立了一套新的角膜缘niche细胞提取、分离和培养方法，进行了角膜缘niche细胞的原代及传代培养。通过超速离心法分离和纯化了niche细胞来源的外泌体，通过Western Blotting 检测发现niche细胞外泌体富含Wnt5蛋白。Niche细胞来源的外泌体可以促进角膜缘干细胞增殖，促进角膜上皮损伤的修复，促进干眼症小鼠模型角膜上皮损伤的修复。niche细胞外泌体作用的角膜缘干细胞，β-catenin蛋白表达在胞质和胞核积累作用随着外泌体浓度增加而增强。. 综上，本研究揭示了角膜缘niche细胞可以通过分泌富含Wnt蛋白的外泌体作用于角膜缘干细胞，调控角膜缘干细胞的自我更新，促进角膜上皮损伤的修复。丰富了niche细胞调控干细胞的理论体系，并为角膜上皮再生和角膜上皮损伤修复提供新的研究策略和干预手段。