植物生长调节剂雌激素活性电化学检测方法的建立及机制研究

In order to achieve high yield, plant growth regulators have been widely used in all aspects of agricultural production. However, the phenomenon of plant growth regulator abuse is extremely serious at present, and people's food safety has brought great hidden dangers, especially its estrogen effect has aroused people's attention. Because the plant growth regulator has a low dose of long-term exposure, lasting effect, the complex mechanism and so on, it is difficult to detect estrogen activity. Therefore, the establishment of a simple, rapid and sensitive detection of new methods has become an urgent problem. Electrochemistry who has the characteristics of fast response and sensitivity has attracted much attention in the field of cell analysis. The correlation between electrochemical behavior of cell and estrogenic effects was found In our previous studies. In this study, we will investigate the relationship among the cell cycle, the expression of cell cycle proteins and the electrochemical behavior of MCF-7 cells, analyze the estrogen effects on this intrinsic link, reveal the mechanism of estrogen activity of purine as a biomarker and investigate the mechanism of estrogen effects of plant growth regulators and establish a new method for the electrochemical detection of estrogenic activity of plant growth regulators. This topic can not only reveal the electrochemical mechanism of cells, but also provide a theoretical basis for the field of toxicological evaluation of plant growth regulators.

为实现高产，植物生长调节剂已在农业生产的各个环节被广泛使用。然而目前，植物生长调节剂滥用现象极为严重，给人们的食品安全带来了极大隐患，特别是其雌激素效应已引起人们的高度重视。由于植物生长调节剂具有低剂量长期暴露、作用持久、机制复杂等特点，导致其雌激素活性检测困难。因此建立简单、快速、敏感的检测新方法已成为亟待解决的问题。电化学具有响应快、灵敏等特点，在细胞分析领域受到广泛关注。我们前期研究发现细胞电化学行为与毒物的雌激素活性之间存在相关性，基于此，本课题拟研究MCF-7细胞周期、相关细胞周期蛋白表达与细胞电化学行为之间的内在联系，分析雌激素对此内在联系的影响，揭示以嘌呤为生物标记物的雌激素活性电化学检测机制，并研究植物生长调节剂的雌激素活性机制，建立植物生长调节剂雌激素活性电化学检测新方法。本课题不仅可以进一步揭示细胞电化学机理，并且可以为植物生长调节剂毒理学评价领域的研究提供理论基础。

由于植物生长调节剂具有低剂量长期暴露、作用持久、机制复杂等特点，导致其雌激素活性检测困难。因此建立简单、快速、敏感的检测新方法已成为亟待解决的问题。电化学具有响应快、灵敏、易小型化等特点，本项目以多壁碳纳米管、不同金属掺杂石墨烯量子点等材料制备了4种对嘌呤敏感的纳米修饰电极，均具有良好的稳定性和平行性，且对嘌呤检测达到了较好的灵敏度；以雌二醇和重金属镉等典型雌激素类物质为模型药物，研究了去激素MCF-7细胞暴露于低剂量雌二醇和镉的电化学行为，通过分析雌二醇和镉雌激素效应诱导的细胞嘌呤代谢相关蛋白表达变化，发现雌二醇和镉诱导的ERα和Cyclin D1表达呈剂量依赖性上调。同时，PRPP酰胺转移酶、GDA和ADA的表达也上调，增加了细胞内次黄嘌呤、鸟嘌呤和黄嘌呤的含量，进而促进了HPRT的表达。嘌呤分解代谢的增强也增加了尿酸的含量。总之，雌二醇和镉的雌激素效应诱导了嘌呤代谢的重头合成、补救合成和分解代谢三个循环，并上调了细胞内次黄嘌呤、鸟嘌呤以及黄嘌呤和尿酸的水平，从而增强了MCF-7细胞的电化学信号。细胞中的嘌呤可作为电化学方法评价雌激素效应的有效生物标志物；通过研究电化学法、MTT法和细胞计数法三种方法检测的不同血清种类、培养基种类、血清去激素方式以及细胞接种数等环境培养因素对MCF-7细胞增殖效应的影响，发现电化学法具有最灵敏的效果；以应用最广泛的植物调节剂赤霉素为模型，研究了赤霉素和ERα抑制剂 ICI 182,780对去激素MCF-7细胞电化学信号的调节，进而对细胞增殖、细胞内嘌呤水平以及嘌呤重头合成和分解代谢的调节，揭示了电化学检测赤霉素雌激素效应机制，建立了植物调节剂雌激素效应电化学检测方法。另外，在研究过程中发现，甲磺酸乙酯引起细胞DNA损伤时，电化学信号有特异性变化，研究了DNA损伤和电化学信号之间的时间、剂量-效应关系，开拓了嘌呤在毒理学检测领域的应用范围。