P38 MAPK信号通路在S. boulardii预防DON诱导猪单核巨噬细胞凋亡的作用研究

Deoxynivalenol（DON）naturally contaminated foods and feeds animal feeds, is toxic and carcinogenic to humans and animals. How to prevent or reduce the risk of DON has been emerged as a big scientific problem. Viewing from molecular mechanism, protein kinases (MAP kinases) p38 signaling pathways is not only an important stress pathway but also the same target for DON and S.boulardii. The main mechanisms of action of S. boulardii inhibits production of pro-inflammatory cytokines MAP kinases, p38 by inhibiting main regulators of inflammation; in contrast, DON evokes production of MAPK p38 to induce inflammation. Whereas it remains unknown how they simultaneously regulate cell apoptosis through that same pathway. For the purpose of better understanding the role of MAPK p38 on S.boulardii reducing the acute or chronic poisoning caused by DON, this research is developed in pig's mononuclear macrophages apoptosis caused by DON ,and used a series of technologies such as the signal pathway inhibitor, immune imprinting, flow cytometry, RT-PCR to explore the intervention mechanism of S.boulardii to pig's mononuclear macrophages, which would be helpful for lay a theoretical foundation to explore the drug preventing DON.

脱氧雪腐镰刀菌烯（DON）是目前粮食与饲料中污染较严重的真菌毒素之一，易造成人和动物的急慢性中毒。如何预防或降低摄入DON后造成的急慢性中毒的风险，是一个严峻而又亟待解决的科学问题。从分子作用机制来看，p38 MAPK是一条应激信号通路，也是唯一的DON与S.boulardii作用细胞的相同信号通路。S. Boulardii能抑制外源因子对此信号通道的激活，抑制相关炎性细胞因子表达，减轻炎症反应；DON导致细胞毒性则是通过激活p38 MAPK细胞信号通道，促使炎性细胞因子的表达，但两者同时作用细胞时，如何通过该通路调控细胞凋亡的作用机制尚未明了。本项目利用猪单核巨噬细胞为研究对象，通过信号通路抑制剂、免疫印迹、流式细胞术、RT-PCR等技术手段，研究p38MAPK在S.boulardii对DON所致猪单核巨噬细胞凋亡的干预作用机制，为该菌作为防治DON导致的急慢中毒的药物奠定理论基础。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），由镰刀菌属、葡萄穗霉属等真菌产生，是威胁食品安全的主要真菌毒素之一。布拉迪酵母（S. boulardii）是一种具有益生作用的酵母菌，对于生物毒素引发的腹泻有良好的疗效。本研究主要探讨布拉迪酵母是否对DON诱导的免疫细胞凋亡的干预作用以及可能的作用机理。运用猪肺泡巨噬细胞（PAM），探究不同浓度的S.boulardii对DON损伤细胞的干预作用，并以两者作用的共同通路—p38MAPK通路为靶点，研究不同剂量S.boulardii对p38MAPK通路的下游炎性因子分泌以及p38蛋白表达的影响，进而阐明S. boulardii干预作用可能的分子机理。.（1）、通过MTT实验与Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡的结果显示，DON毒素对PAM的毒性作用呈现时间和剂量依赖性，随毒素浓度升高，对细胞生长的抑制率逐渐增大，凋亡率上升。利用ELISA等手段检测DON对炎性因子IL-6、TNF-α和IL-lβ分泌量的影响结果显示，在DON浓度为4μM时，炎性因子随着DON的作用时间呈先升后降的趋势，4h时显著升高。炎性因子mRNA表达量随DON浓度升高呈上升趋势，8μM时呈极显著差异（P<0.01）。.（2）、酵母菌与DON共同作用于PAM时，采用流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示：随酵母菌浓度升高，降低了PAM的凋亡率，同时抑制了DON对炎性因子IL-6、T'NF-α和IL-lβ表达量的上调，较高浓度S. boulardii（5×106个/mL）作用显著（P<0.05）。对于凋亡调控基因Bcl-2/Bax与Bcl-xl/Bax，中剂量的S. boulardii 相比DON毒素处理组极显著（P<0.01）上调了该比值，促使细胞发挥抗凋亡作用。DON 明显上调了p38的mRNA表达，中剂量（5×105个/mL）的S. boulardii则极显著（P<0.01）下调了p38mRNA表达。Westernblot检测P38蛋白组表达水平结果显示，S. boulardii能够抑制p38蛋白的磷酸化，阻滞p38MAPK通路的激活。.结果综合表明，S.boulardii能够降低p38的表达，并且抑制DON对p38MAPK通路的激活而降低下游炎性因子的表达，同时上调抗凋亡因子的表达，从而抑制细胞凋亡。