单核增生李斯特菌分子检测标记发掘新方法

发掘高特异性分子检测标记是解决当前制约食源性致病菌分子检测技术的瓶颈.和难题。本研究基于生物信息学和比较基因组学的理论和当前微生物基因组信息资源，采用.生物信息学和比较基因组学相结合的策略，通过对食源性致病菌单核增生李斯特菌基因组序.列片段和其它生物基因组序列的综合比较分析、筛选和生物学验证，构建具有我国自主知识产权的食源性致病菌分子检测标记发掘的新方法，并利用该方法发掘若干个单核增生李斯特菌特异性分子检测标记，进而建立具有我国自主知识产权的单核增生李斯特菌PCR快速检测技术。.本研究不仅可以解决当前食源性致病菌分子检测标记特异性不高和数量较少这一制约分子检测技术的推广和应用的关键问题，而且有助于扭转我国在食源性致病菌检测领域缺乏具有自主知识产权检测标记和快速检测技术的落后局面，为政府执法部门加强食品安全监测提供技术支撑。

基于对12株单核增生李斯特菌基因组数据和其他生物的已经公布的核酸序列数据进行两种不同策略的基因序列比较分析，获得单核增生李斯特菌候选的分子检测标记序列；通过生物学验证试验，首次获得具有种特异性的3个分子检测新标记，进而分别以lmo0202 hly和lmo1035-lmo1037的部分DNA序列作为扩增靶标，建立了普通PCR检测技术和添加扩增内标的单核增生李斯特菌分子检测技术。结果表明，该方法对试验中39株单核细胞增生李斯特菌和8株阴性菌株（绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌、威氏利斯特菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌株、粘质沙雷菌）能够扩增出所有阳性样品的目标产物，阴性对照均无目标产物的出现，显示出极强的单核增生李斯特菌特异性;该检测方法的灵敏度为1.304fg/μL;用此方法检测40份人工污染样品，检测结果中都为阳性，表明该检测方法具有较高的准确性。在添加扩增内标的单核增生李斯特菌检测方法中，构建了包含扩增引物序列的长度为541bp的扩增内标序列，40株单核细胞增生李斯特菌和30株非单核细胞增生李斯特菌分别进行检测扩增，只有单核细胞增生李斯特菌都能扩增出455bp的目标序列特异性产物和541bp的扩增内标产物，而非单核细胞增生李斯特菌只能扩增出541bp的扩增内标产物，添加6.06×105拷贝的扩增内标在PCR检测体系中，检测方法的核酸检测灵敏度为11.8fg/μL，不受猪霍乱沙门氏菌、金色葡萄球菌、大肠杆菌的干扰；该扩增内标PCR检测技术的菌落灵敏度为3.44×104CFU/ml。