沙门菌毒力基因spv对DCs自噬和免疫调节功能的影响及机制研究

自噬是早于凋亡发生的另一种程序性细胞死亡方式，其作用是一把"双刃剑"，适度激活可对机体起保护作用。鉴于树突状细胞（DCs）在免疫应答中的重要性和伤寒沙门菌感染后可产生终身免疫的特性，本研究以我国发现的伤寒沙门菌"嵌合型"质粒pRST98上spv毒力基因这一重要资源为切入点，在发现携带spv的沙门菌能通过影响DCs自噬水平而导致免疫调节功能变化并加重感染的工作基础上，拟用spv基因构建的重组沙门菌，利用细胞模型和敲基因鼠动物模型，研究spv基因与DCs自噬/溶酶体途径激活的相关性及其通过PI3K-AKT-mTOR和MyD88-NF-κB信号调控网络，特别是与Toll样受体的关系，从而获得具有创新性自主知识产权的致病基因，揭示spv对DCs自噬水平及免疫功能影响的分子机制，寻找其作用的关键靶位，提出通过调控细胞自噬来增强机体免疫功能以控制感染的新策略，并为后续新药靶位的发现提供理论和实验依据。

自噬是早于凋亡发生的另一种程序性细胞死亡方式，其作用是一把“双刃剑”，适度激活可对机体起保护作用。本课题分别以细胞模型、动物模型研究沙门菌质粒pRST98及其毒力基因（Salmonella plasmid virulence genes，spv）对自噬、凋亡和免疫调节功能的影响并探讨其分子机制。.一、以携带pRST98的伤寒沙门菌野生株ST8、质粒消除株ST8-Δ-pRST98及回补株ST8-c-pRST98，分别与与小鼠骨髓来源的DCs、人巨噬细胞THP-1和小鼠巨噬细胞J774A.1共培养，并设立自噬激动剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）干预组。检测细胞表面共刺激分子的表达、细胞因子水平、自噬相关蛋白的表达及NO的产生，透射电镜观察细胞超微结构的改变。结果提示，pRST98能增强宿主菌诱导细胞凋亡，其细胞毒性依赖于对细胞NO的抑制作用；pRST98能抑制细胞的自噬、成熟和细胞因子的分泌，诱导细胞产生以Th1保护性应答为主的免疫反应。.二、用鼠伤寒沙门菌标准毒株SR-11和spv基因突变株构建稳定表达荧光素酶基因的重组发光菌SR-11-Lux和SR-11-Δspv-Lux。将受试菌感染小鼠，另设RAPA干预组。小动物活体成像仪观察细菌增殖、播散和脏器改变，检测自噬、凋亡、免疫指标和脏器活菌数。结果显示，野生株的播散速度和脏器病变明显高于突变株，可通过抑制自噬、促进凋亡而加重感染；用RAPA干预后自噬被适度激活，对机体有一定的保护；野生株通过抑制小鼠DCs成熟，抵抗和逃逸宿主的免疫防御，而RAPA可促进DCs的成熟，通过增强自噬促进Th1类细胞因子的分泌从而发挥抗胞内菌感染的作用。.三、将受试菌与上皮细胞Hela、野生型小鼠成纤维细胞MEFs及自噬基因5缺陷型MEFs共培养，检测自噬相关指标、磷脂酶D和Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）蛋白的表达，测定TLR4的mRNA转录水平、细胞因子和胞内活菌数。结果提示，spv可通过抑制细胞TLR4的表达增加磷脂酶D活性，同时抑制Th1、促进Th2型细胞因子分泌导致Th1/Th2免疫漂移，其信号通路与丝氨酸/苏氨酸激酶依赖性方式激活TOR激酶密切相关。.相关成果发表SCI论文7篇及《微生物学通报》等核心期刊论文十余篇，培养6名研究生。