Dot1L调控有丝分裂期纺锤体检查点及骨肉瘤发生发展的机制研究

Osteosarcoma is the most common histological form of primary bone cancer.The clinical outcome is poor due to lack of molecular druggable targets. The investigation of the epigenetic regulation and mitotic spindle assembly checkpoint will provide more potential targets for drug development. We have found that, in osteosarcoma cell lines, Dot1L had been phosphorylated in prometaphase ,and dephosphorylated after anaphase onset. The level of its substrate H3K79me2/3 had the inverse relationship with phosphorylation of Dot1L. And the chromosome missegregation had increased dramatically after treating the Dot1L specific inhibitor, which meant that the spindle assembly checkpoint had lost its function. We hypothesize that phosphorylation of Dot1L regulates it’s methyltransferase activity and spindle assembly checkpoint activation, furthermore, Dot1L has impact on the transcriptional pattern of next G1 through methylation of H3K79. Different screening approaches will be employed to investigate the molecular mechanism of Dot1L related regulation and proliferation of human osteosarcoma cells. The discoveries made from the proposed study will provide a new mechanism to understand the regulation of spindle assembly checkpoint and the mitotic bookmarking. And this will also offer a solid mechanistic basis for the development of new druggable molecules for osteosarcoma treatment.

骨肉瘤作为最常见的骨组织产生的恶性肿瘤，目前治疗手段有限且靶向性不强。表观遗传研究及有丝分裂期纺锤体检查点研究都能为骨肉瘤的临床治疗提供更好的药物靶标。本课题组前期研究发现，骨肉瘤细胞系中表观遗传调控分子Dot1L在有丝分裂期前中期发生特异性磷酸化修饰。此修饰与周期时相有关，并与其底物H3K79甲基化水平负相关。抑制Dot1L甲基转移酶活性导致有丝分裂错误增多，即纺锤体检查点调控异常。因此提出假说Dot1L甲基转移酶活性受磷酸化修饰调控，且Dot1L对有丝分裂期纺锤体检查点及子代继承母代细胞表达模式都具有调控作用。本项目拟主要运用相互作用筛选、甲基化底物筛选、CHIP-seq、RNA-seq等方法明确Dot1L调控有丝分裂期纺锤体检查点和表达模式遗传的分子机制及在骨肉瘤发生发展中的作用机制。本课题的完成将有助于揭示Dot1L的双重调节功能，也将为开发新的骨肉瘤治疗药物提供理论依据。

异倍体作为大多数实体瘤的共同特征，是基因组不稳定性的突出表现，在肿瘤发生发展和化疗耐药中发挥着不容忽视的生理作用。有丝分裂期纺锤体组装检查点对于防止分裂错误的发生和随后异倍体的出现意义重大。表观遗传调控分子DOT1L是唯一催化组蛋白H3 第79位赖氨酸发生甲基化（H3K79me1/2/3）的甲基转移酶，DOT1L及其底物H3K79me1/2/3与纺锤体组装检查点的关系尚未见相关报道。本项目发现DOT1L在有丝分裂期发生特异性的磷酸化修饰，其底物H3K79me3甲基化水平与Dot1L磷酸化水平正相关。利用活细胞实时成像和免疫荧光实验，结合特异性抑制剂，siRNA和CRISPR/Cas9等技术，发现DOT1L功能异常导致有丝分裂期时间明显延长，染色体碎裂、桥连、微核等异倍体细胞比例显著增高，提示DOT1L参与细胞有丝分裂进程调控。检测着丝粒与微管的连接发现，DOT1L敲低的细胞在有丝分裂中期着丝粒与微管正确连接的比例明显降低，姐妹着丝粒之间的张力减小，且细胞纠正着丝粒-微管错误连接的能力明显减弱。负责检查及纠正着丝粒-微管错误连接的染色体乘客复合体（CPC）核心成员Aurora B在着丝粒上的定位明显减少。检测着丝粒附近Survivin、H3T3磷酸化、Sgo1、H2AT120磷酸化等分子发现，敲低或抑制DOT1L酶活性不影响H2AT120磷酸化水平，但是H3T3磷酸化水平显著降低，并通过H3T3ph-Survivin途径导致Aurora B着丝粒定位减少。检测H3T3的激酶Haspin和磷酸酶PP1γ/RepoMan发现，敲低或抑制DOT1L酶活性不影响蛋白激酶Haspin对H3T3ph的磷酸化，但是增加了PP1γ调节亚基RepoMan的染色体定位。免疫共沉淀以及体外结合实验表明H3K79甲基化水平直接调节了RepoMan与组蛋白H3的亲和力，通过间接调控H3T3的磷酸化水平影响CPC复合物招募到着丝粒上的量，进而达到精细调控细胞有丝分裂进程的目的。本项目的研究成果不仅详细阐述了一个新的有丝分裂期纺锤体检查点调控机制，为表观遗传调控分子DOT1L参与细胞周期调控提供了新的证据，还为不同组蛋白修饰形式（Histone Codes）相互精细调控发挥生物学功能提供了新的实例。同时也为肿瘤的精准治疗提供了新的靶点和联合用药治疗策略的理论基础。