FAM35A-C20orf196复合物在DSB修复通路选择调控中的功能研究

DNA double-strand break (DSB) is the most serious type of DNA damage in the cell. The repair is accomplished mainly by two repair pathways of homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). 53BP1/RIF1 and BRCA1/CtIP antagonize each other and regulate the selection of two repair pathways. 53BP1/RIF1 and downstream protein, REV7, are known to inhibit HR by blocking the DNA end resection, however, the specific mechanism is not clear. Through immunoprecipitation and mass spectrometry, we found two novel REV7 binding proteins, FAM35A and C20orf196. Preliminary work showed that FAM35A was involved in NHEJ pathway, and restored DNA end resection and RAD51 loading in BRCA1-depleted cells. It seems exciting that FAM35A contains 3 OB-fold domains, which are usually used to bind single-strand DNA (ssDNA). We will detect the ability of FAM35A to bind ssDNA. We will also establish a system of DNA end resection in vitro, and then study whether FAM35A has the function of blocking resection. The completion of this research will further improve people's understanding of the existing DSB repair pathway choice, so as to provide a theoretical basis for cancer treatment with synthetic lethal strategy.

DNA双链断裂（DSB）是细胞内最为严重的一种DNA损伤方式。其修复主要由同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两条途径来完成。53BP1-RIF1和BRCA1-CtIP相互拮抗，调控这两个修复通路的选择。已知53BP1-RIF1以及下游蛋白REV7通过阻碍DNA末端剪切（end resection）来抑制HR，然而，其具体机制并不清楚。我们发现了两个新颖的REV7结合蛋白，FAM35A和C20orf196。前期工作表明，FAM35A参与NHEJ修复途径并且拮抗了BRCA1依赖的DNA末端剪切。有意思的是，FAM35A含有3个通常用来结合单链DNA的OB-fold结构域。我们将检测其结合ssDNA的能力，并在体外建立DNA末端剪切的系统，研究FAM35A是否具有抑制剪切的功能。本课题的完成，将进一步完善人们对现有DSB修复选择机制的理解，从而为以合成致死为策略的癌症治疗提供理论基础。

生物体中DNA无时无刻都会受到来自内源和外缘的损伤威胁，受损的DNA则依赖于生物中保守的DNA损伤修复机制进行弥补和修正。在各种DNA损伤中，DNA双链断裂（double-strand break，DSB）是最具毒性的一种。而DSBs的修复主要依赖于同源重组（homologous recombination，HR）和经典的非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）两种修复途径。已知53BP1和下游蛋白RIF1,PTIP以及REV7，拮抗了BRCA1依赖的HR并促进NHEJ，但分子机制并不清楚。. 我们的工作表明，REV7与两个蛋白FAM35A和C20ORF196形成复合物。FAM35A在体外倾向于结合单链DNA，并与C20ORF196和REV7以复合物的形式被招募到细胞内DSBs。遗传上位分析表明，FAM35A和C20ORF196与RIF1位于NHEJ修复通路的同一途径中。BRCA1突变细胞中HR通路的缺陷以及断裂DNA末端切除的减少能够很大程度上被FAM35A或C20ORF196的缺失所抑制，说明FAM35A和C20ORF196在这些细胞中抑制了末端切除。综上，我们的实验鉴定出REV7-FAM35A-C20ORF196复合物 (Shieldin 复合物），该复合物能够结合并且保护断裂DNA末端，促进DSB修复的NHEJ通路。. 此外，通过FlAG-IP联合质谱实验发现了一个和Shieldin 复合体相互作用的蛋白SCIP (Shieldin complex interaction protein)。初步实验证明SCIP响应激光微辐射损伤并被招募到DSB损伤位点。在53BP1和RIF1缺失的细胞中SCIP招募明显减弱，符合SCIP在53BP1-RIF1-Shieldin复合体下游的假设。在鸡淋巴细胞DT40细胞系中SCIP蛋白的缺失可以回补BRCA1突变体对PARP1抑制剂奥拉帕博(Olaparib)的敏感性以及对RAD51招募的缺陷，这些数据都说明SCIP可能是Shieldin 复合体下游抑制末端切除并促进NHEJ的效应因子。