尾加压素及其受体介导卵圆细胞在肝癌形成中的作用和分子机制

The mechanism of Hepatocellular carcinoma (HCC) remains unclear, and many researchers thought cell abnormal proliferation in the liver involved in HCC. Our works firstly found hepatic oval cells (HOCs) can excrete UII, and further promote HOCs proliferation. However, it is unclear how UII involved in HCC. Our previous works proved UII and its receptor (UT) are up-regulated in rat precancerous lesions, and our preliminary experiment found UII and UT were up-regulated when H2O2 malignant transformation of HOCs was induced by H2O2. We supposed reactive oxygen species (ROS) increasing in HOCs can up-regulate UII/UT expression, and further induce malignant transformation of HOCs, which induced the occurrence of HCC. In order to confirm this hypothesis, we adopted molecular biology technique, flow cytometry, small animal CT and bioluminescence in vivo to observe the effect of up-regulation of UII/UT on HCC occurrence and malignant transformation in human hepatitis, hepatic cirrhosis, rat precancerous lesion and the model of HOC malignant transformation. This study will clarify molecule mechanism of HCC from new vision to provide new target for prevention and cure of HCC.

肝癌（HCC）的发生机制尚未阐明，多认为与肝内细胞异常增殖有关。尾加压素（UII）及受体（UT）可促细胞增殖。我们首次发现肝组织有UT存在，肝卵圆细胞（HOCs）可分泌UII，证实UII/UT参与HOCs增殖。但UII/UT与HCC的关系，迄今尚无报道。我们发现大鼠肝癌前病变有UII/UT高表达，预实验观察到H2O2刺激HOCs恶性转化时UII高表达。推测ROS引起HOCs中UII/UT高表达可诱导HOCs恶性转化，可能是HCC发生的新机制。为证实假说，我们拟用人肝炎、肝硬变、HCC病变肝组织，并复制大鼠肝癌前病变、肝癌及HOCs恶性转化模型，用免疫组化、分子生物学、流式细胞仪、小动物CT及活体生物发光和荧光成像等技术，从整体-肝组织-细胞三个层次，观察UII/UT表达增加对HCC发生发展、HOCs恶性转化的影响及分子机制。本课题将从新的视觉阐明HCC发生的分子机制，并为其防治提供新靶点。

通过临床病理、体外实验及裸鼠成瘤实验，明确UII在肝癌的发生和发展中的作用。结果显示：人肝癌组织中ROS水平明显高于癌旁组织，NADPH氧化酶亚基p47phox、NOX2、p40phox及p67phox表达明显高于癌旁组织。UII刺激WB细胞，p47phox、NOX2、p40phox和p67phox表达也呈现上调现象，应用Apocynin预处理能够影响UII介导的p47phox的表达。通过流式细胞术方法检测细胞内ROS水平，结果提示urantide及Apocynin存在下，均能影响UII介导的ROS水平上调。表明UII可通过NADPH氧化酶途径介导ROS产生。Western blot结果显示UII作用于WB细胞可增加PI3K/Akt和ERK的磷酸化水平。Apocynin预处理干预ROS产生后，UII介导的S期细胞比例增加同样受到抑制。通过检测调控G1/S期相关蛋白发现，抑制ROS产生后，UII上调的cyclinE和CDK2表达相应下降。Apocynin预处理后影响了UII介导的促细胞增殖作用。随着UII的长期刺激，细胞形态出现变化，细胞核与细胞质比例增大，细胞生长的极性逐渐减弱。Western blot检测结果显示WB细胞中的UTR、AFP和c-myc表达逐渐呈现上调趋势。将细胞接种软琼脂培养基中进行集落培养，随着刺激时间的延长，细胞集落的数量和体积随之逐渐增大。将恶性转化的细胞接种于裸鼠右侧背部皮下，50天后观察成瘤情况，发现UII刺激组裸鼠成瘤率为62.5%。结论：肝癌微环境中的高UII可能引起活性氧产生增加。UII作用于肝脏前体细胞，可激活细胞内NADPH氧化酶介导ROS产生，继而ROS可参PI3K/Akt及ERK的激活，加速细胞从G0/G1期进入S期，发挥促细胞增殖作用。UII可引起细胞发生恶性转变，在裸鼠体内致肿瘤形成。表明UII在肝癌的发生发展中具有重要作用。