番茄表皮毛调控基因SlHDZIV8下游靶基因的筛选和功能鉴定

Trichomes, developing from the plant epidermis, provide structural resistance against insect herbivores and an excellent model to study the molecular mechanisms underlying cell fate determination. Trichomes have unicellular and multicellular structure. Regulation of unicellular trichome in Arabidopsis has been well characterized. A typical MYB/bHLH/WD40 complex regulates the expression of downstream genes and triggers the trichome formation. However, little is known about the multicellular trichome formation in tomato. We have previously cloned and characterized the HD-Zip IV transcription factor SlHDZIV8 in tomato. In this study, we will create a fusion construct P35s::SlHDZIV8-FLAG and transform it into tomato cultivar Ailsa Craig mediated by agrobacterium. And then we will analyze the downstream target sites of SlHDZIV8 using Chromatin Immunoprecipitation followed by high throughput DNA sequencing. Combining with RNA-seq, Q-PCR, Y1H and EMSA, we will determine trichome closely related genes, identify their function and illustrate the regulatory pathway mediated by SlHDZIV8. It is worthwhile to enrich the molecular mechanism of plant cell fate choice.

表皮毛是由植物表皮细胞发育而来，能减少或抵御植食性昆虫的危害，同时也是研究植物细胞命运调控的模式系统。表皮毛分为单细胞和多细胞两种类型，拟南芥单细胞表皮毛的调控途径已经较为清楚，是由MYB/bHLH/WD40蛋白复合体调控下游基因促进表皮毛的形成。番茄多细胞表皮毛的调控途径与之不同，还有待深入研究。本研究在前期克隆和鉴定番茄HD-Zip IV型转录因子SlHDZIV8表皮毛调控功能的基础上，拟进一步构建融合表达载体P35s::SlHDZIV8-FLAG转化番茄栽培种Ailsa Craig，采用染色质免疫共沉淀-测序技术筛选SlHDZIV8基因在全基因组范围内可能的靶位点，并结合RNA-seq、Q-PCR、Y1H、EMSA等技术确定下游靶基因，转基因分析确定候选靶基因的表皮毛调控功能，揭示由SlHDZIV8基因介导的表皮毛调控途径，对丰富植物细胞命运决定的分子机制具有重要意义。

表皮毛是由植物表皮细胞发育而来，能减少或抵御植食性昆虫的危害，同时也是研究植物细胞命运调控的模式系统。表皮毛分为单细胞和多细胞两种类型，拟南芥单细胞表皮毛的调控途径已经较为清楚，是由MYB/bHLH/WD40蛋白复合体调控下游基因促进表皮毛的形成。番茄多细胞表皮毛的调控途径与之不同，还有待深入研究。.本人前期克隆和鉴定了番茄HD-Zip IV型转录因子SlHDZIV8表皮毛调控功能。为了揭示SlHDZIV8基因介导的番茄表皮毛调控机制，利用RNA-seq筛选SlHDZIV8基因在全基因组范围内可能的靶位点，通过转录组数据分析，结合Q-PCR、基因注释等候选了2个表皮毛发育相关基因（SlnsLTP33和SlGID1L2），分别构建超量表达/基因编辑载体，通过农杆菌介导的遗传转化法转化番茄Ailsa Craig以进行功能验证。目前研究结果表明：.通过组织表达谱分析，结果显示SlnsLTP33在番茄成熟叶中表达量最高，在绿熟期果实中表达次之，在根和红熟期果实中表达量最低。通过组织化学分析，结果显示SlnsLTP33在番茄表皮毛、叶脉、叶片、生长点处都有表达。通过亚细胞定位，结果显示SlnsLTP33蛋白定位于细胞质膜上。与对照相比，SlnsLTP33-OE超量表达株系的表皮毛密度呈现增多的趋势且表皮细胞变小。SlnsLTP33-CoR共抑制植株表皮毛密度呈现明显减少，且细胞形态发生改变。而SlnsLTP33-CR基因编辑植株表皮毛密度明显减少。利用酵母单杂交系统、LUC活性测定实验验证了SlHDZIV8结合到L1-box顺式元件上调控SlnsLTP33基因的表达，进而影响表皮毛的形成。.通过组织表达谱分析，结果显示SlGID1L2在根中表达量最高，在破色期果实和花中次之，在幼果期几乎不表达。通过亚细胞定位，结果显示SlGID1L2蛋白定位于细胞质膜上。SlGID1L2过表达后，番茄种子的发芽势和发芽率显著提高，植株的开花时间明显提前、花序和花朵数量增多。SlGID1L2基因编辑植株茎上表皮毛密度减少。通过酵母单杂交实验，结果显示SlHDZIV8与SlGID1L2不直接互作。