基于TLR4-NFkB通路研究烟曲霉文丙抗动脉粥样硬化作用机制

心血管系统疾病目前仍是世界上最主要的死因之一。动脉粥样硬化（AS）是心血管系统疾病主要的病理生理基础，AS斑块破裂和继发的血栓形成是致命性疾病,如心肌梗死、中风等的元凶。脂代谢紊乱和炎症是AS发病的两个主要病因。Toll样受体4（TLR4）是将脂代谢紊乱和炎症这两条贯穿AS发病的主线联系到一起的桥梁，成为抗AS药物新的治疗靶点。我们课题组首次提出烟曲霉文丙（FumC）能拮抗TLR4，治疗AS。本研究拟在前期工作的基础上，采用Realtime PCR、ELISA、细胞免疫化学等手段，利用基因转染技术，确认FumC有抑制TLR4的作用；在AS家兔和载脂蛋白E敲除（ApoE-/-）的小鼠上确认FumC的抗AS作用。并从TLR4-NFκB途径深入分析FumC抗AS的作用机制。试图从深层次寻找脂代谢紊乱和炎症间的联系。本研究有望为抗AS提供新的理论指导和新的药物来源。

本项目首先明确了烟曲霉文丙（Fumigaclavine C，FC）有降脂作用。给予FC（20 mg/kg）4周后，能降低胸主动脉和主动脉瓣冰冻切片被油红染红的面积。FC也能剂量依赖性地降低小鼠血清中低密度胆固醇酯(LDL)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)的含量，升高高密度胆固醇酯(HDL)的含量。主动脉石蜡切片，HE染色后发现，FC治疗能显著改善血管壁增厚的状态，并减少了血管内脂质的含量。细胞学实验表明，FC能显著降低oxLDL刺激人单核巨噬细胞Thp1后泡沫细胞的形成。FC能剂量依赖性地降低LPS刺激后人全血和RAW264.7细胞TNFa的产生, 用流式细胞仪和western blot法检测到FC能抑制LPS刺激RAW264.7细胞或小鼠腹腔巨噬细胞后，因炎性反应增高的TLR4和NFkB的表达。明确FC有抗炎作用。随后，研究了FC降脂抗炎的作用机制。将TLR4转染到293T细胞，给予FC降低了TLR4的过表达；将NFkB-luciferase 的质粒转染RAW264.7细胞，给予FC后，可减少NFkB-luciferase 的发光。为明确TNFa的产生是通过抑制TLR4的表达而非其他的Toll样受体，考察了FC对TLR2, TLR3, TLR4及TLR9的作用，发现FC对TLR4的配体LPS刺激后TNFa的产生有显著抑制作用。通过上述实验确定了FC的抗炎作用是通过抑制TLR4-NFkB途径起作用的。在整体实验中，发现了FC能降低小鼠肝脏TLR4和NFkB的蛋白表达。又考察了FC对oxLDL刺激后，RAW264.7细胞PPARγ表达的影响。FC能剂量和时间依赖性地促进PPARγ的RNA及蛋白表达。在ApoE-/-小鼠肝脏中，FC能剂量依赖性地降低了过表达的TLR4和NFkB， 提示FC有抗炎作用。 此外，给予FC后增加了小鼠肝脏中与脂代谢相关的ABCA1、ABCG1和PPARr的表达。将PPRE-luciferase转染Thp1细胞，FC能显著增加PPRE的luciferase。 说明FC的降脂作用可能是通过PPAR-LXR-ABCA途径起作用的。此外，我们也筛选了近百个结构/来源和FC类似化合物的抗炎作用，并具体研究了Trichothecin的活性作用机制。本项目进展顺利，相关结果共发表SCI收录的文章2篇，中文核心期刊1篇, 尚有部分数据在整理投稿中。