基于PI3K/Akt信号通路探讨大黄蛰虫丸抑制糖尿病视网膜毛细血管周细胞凋亡相关机制的研究

The pericyte of retinal capillary cells in peripheral blood capillary, have to maintain the important physiological function such as vascular permeability and stability. Pericyte's loss is diabetic retinopathy characteristic pathological change. Rhubarb eupolyphaga pill treatment of diabetic retinopathy is based on collateral theory of traditional Chinese medicine and put forward, and pericyte is the structure of the collateral foundation of traditional Chinese medicine. Our previous study showed that the rhubarb eupolyphaga pill can significantly inhibit the experimental diabetic rats retinal capillary cell apoptosis. PI3K/Akt signaling system plays an important role in regulating apoptosis. This topic using light microscope, electron microscope, image analysis, immunohistochemistry, Western blot, in situ PCR and rt-pcr technique, observation of rhubarb eupolyphaga pill on experimental diabetic rats intervention in treatment of retinal capillary cell apoptosis morphological changes, FI3K, Akt content in detection of retinal tissue, and the pathways inhibitory factor PTED upstream and downstream MDM2, nf-kappa B, FKHR, BAD, caspase -9 the expression of apoptosis related factors, explore rhubarb eupolyphaga pill in the treatment of diabetic retinopathy mechanism of complex cure "collateral" of traditional Chinese medicine philosophy provided the scientific basis.

视网膜毛细血管周细胞位于毛细血管外周, 具有维持血管通透性及稳定性等重要的生理功能。周细胞的丧失是糖尿病视网膜病变特征性病理改变。大黄蛰虫丸治疗糖尿病视网膜病变基于中医"络病"理论而提出，周细胞是中医"络"的结构基础。我们前期研究显示，大黄蛰虫丸能明显抑制实验性糖尿病大鼠视网膜毛细血管周细胞的凋亡。PI3K/Akt信号传导系统在调节细胞凋亡方面具有极为的重要作用。本课题采用光镜、电镜、图像分析、免疫组织化学、Western blot、原位PCR、RT-PCR等技术，观察大黄蛰虫丸对实验性糖尿病大鼠干预治疗下视网膜毛细血管周细胞凋亡的形态学改变，检测视网膜组织中FI3K、Akt的含量，以及该通路上游抑制因子PTED及下游MDM2、NF-κB、FKHR、BAD、caspase-9等凋亡相关因子的表达，探讨大黄大黄蛰虫丸治疗糖尿病视网膜病变的作用机理，为中医"络病络治"理念提供科学依据。

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病微血管病变中最常见、也是最严重的并发症之一。随着糖尿病发病率的日益升高，DR已成为我国最重要的致盲性眼病。本病以视网膜毛细血管的损伤为主要临床特征，并终因增殖性改变而失明。因此，防止及修复糖尿病微血管的损害，是阻断病情发展、保护有效视力的根本环节，也是中西医致力于解决的难题。主要内容：本研究提出大黄蛰虫丸可能通过调节PI3K/Akt信号通路中相关因子的表达，从而发挥抑制周细胞凋亡的作用。据此，本研究观察了此方干预糖尿病视网膜病变发病过程中不同时期周细胞凋亡的形态学改变，在基因水平和蛋白水平定性定量检测视网膜组织中各凋亡相关因子的含量及分析其之间的相关性，探讨毛细血管周细胞凋亡以及大黄蛰虫丸抑制周细胞凋亡的分子机制。重要结果：形态学观察显示：运用大黄蛰虫丸后各剂量组视网膜毛细血管形态和周细胞结构优于模型组。中、高剂量组效果尤为明显（P＜0.05）。RT-PCR检测结果：灌胃6周和12周，与模型组相比，大黄蛰虫丸高中低剂量组视网膜中PI3K、Akt的含量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学法结果显示：运用大黄蛰虫丸灌胃治疗后，与模型组对比均有明显差异（P＜0.05），其中，大黄蛰虫丸中高剂量组各因子表达优于低剂量组，中、高剂量组表达强弱无差异。Western blot法检测结果显示：灌胃6、12周后，与模型组相比，大黄蛰虫丸低中高剂量组PI3K、Akt 、MDM2蛋白相对表达量升高（P＜0.05），PTEN、P53、NF-κb、FKHR、BAX、caspase-9蛋白相对表达量下降（P＜0.05），其中，大黄蛰虫丸中高剂量组各因子表达最接近空白组，灌胃12周效果优于灌胃6周（均为P＜0.05）。关键数据及其科学意义：本研究验证了大黄蛰虫丸对糖尿病视网膜微血管损伤的修复作用，探讨大黄蛰虫丸可能通过调节PI3K/Akt信号传导通道相关因子抑制周细胞凋亡的作用机制，为中医“络病络治”的理念提供了科学依据，为糖尿病视网膜病变的药物治疗提供了有力的参考依据。