家蚕Corazonin受体信号转导及生理过程调控的分子机制研究

The regulation of energy metabolism in insects depends on the effect of Corazonin (Crz) which is mediated by Corazonin receptors (CrzR), it is essential to interpret the mechanism of Crz through studying CrzR. In our previous study, we have cloned CrzR’s gene, understood the coupling relationship between CrzR and G protein and established a stable CrzR expression system in cell and the methods to determine receptor-ligand binding and functional activity. Based on those studies, this project aims to explore the mechanism of CrzR signal transduction and that on regulation of physiological precesses in Bombyx mori by the following studies on CrzR: signal transduction pathway and its molecular mechanism, endocytosis and intracellular transport mechanism, structure-activity mechanism, CrzR’s eapression profiles at difference tissues and development stages and their relationship with growth and development, reproduction, spinning and cocoonig. The breakthrough of this basic research could help us to understand the energy metabolism and regulation mechanism in growth and development, reproduction, spinning and cocooning of Bombyx mori. And it could also provide theoretical basis for further utilization of Crz/CrzR system and promote the traditional technology of sericulture. Furthermore, it could contribute to the promotion of research progress in the field of G protein coupled receptor of insect.

调控昆虫物质生理代谢的Corazonin（Crz），其作用是通过Crz受体（CrzR）来介导的，研究CrzR对于解明Crz作用机制是必要的。本项目在我们克隆了家蚕CrzR基因、了解了CrzR与G蛋白的偶联关系、建立了CrzR稳定表达系统及受体配体结合活性和功能活性检测方法等的研究基础上，通过家蚕CrzR信号转导通路及其分子机制，CrzR内吞和胞内转运机制，CrzR结构与功能的构效机制，CrzR在不同品种、不同组织和不同发育时期蚕幼虫、蛹体中表达及与蚕生长发育、繁殖、吐丝结茧的相互关系等研究，探明家蚕CrzR信号转导及家蚕生理过程调控的分子机制。这一基础问题突破，有助于在本质上认识和了解家蚕生长发育、繁殖、吐丝结茧中的物质能量代谢及其调控机制；可为进一步利用Crz/CrzR系统调节家蚕生理机能，进行传统养蚕业技术提升等，提供很好的理论基础；可为推进我国昆虫G蛋白偶联受体领域研究进展作出贡献。

家蚕的物质生理代谢等受到Corazonin（Crz）等神经肽的调控，而Crz作用是通过Corazonin受体（CrzR）来介导的，研究CrzR对于解明Crz作用机制是必要的，但国内外对家蚕CrzR的研究一直滞后。本项目通过家蚕CrzR的信号转导、构效、生理过程调控等系列研究，克隆出了家蚕CrzR基因并查明了其定位表达特性；家蚕CrzR通过与Gαq和Gαs蛋白偶联来激发细胞Ca++释放和cAMP水平提高，同时引起ERK1/2磷酸化水平增加，从而将胞外信号跨膜传递到胞内，这一信号转导过程在PKA/胞外Ca++/PKC/MEK的参与下完成；家蚕CrzR在Crz刺激下快速内吞，呈现明显的时间和浓度依赖性，其内吞需要招募协助蛋白β-arrestin1/2到细胞膜上并受到PKA、胞外Ca++和PKC的调控，内吞后大部分通过进入早期内含体中循环再回到细胞膜上；Crz的11个氨基酸是实现其活性所必不可少的，其中[Arg7]Crz对于家蚕CrzR有着更高的生物活性；在家蚕CrzR△408-422结构域中，包含着其内吞必需位点或功能区，其中411（Thr）、412（Ser）和413（Ser）丝氨酸/苏氨酸簇是其内吞的关键位点；家蚕CrzR基因在蚕幼虫不同组织中的表达水平存在明显差异，在丝腺和中肠中的表达水平分别为最高和最低；给5龄蚕体外注射Crz，引起蚕体重、全茧量、茧层量的明显降低，给5龄蚕体外注射CrzRsiRNA以干扰CrzR表达，引起蚕体重、桑叶食下量、全茧量的明显增加，显示家蚕Crz/CrzR参与了家蚕生长和蚕茧产质量等经济性状的调控；从家蚕脂肪体中克隆到了Kurtz基因，其开放阅读框长1236 bp，编码的Kurtz蛋白与哺乳动物Arrestins蛋白（β-arrestin1/2）的氨基酸序列具有很高的相似性，家蚕CrzR内吞需要招募kurtz蛋白到细胞膜上，kurtz蛋白作为内吞的主要调控因子在家蚕CrzR等GPCR信号通路中发挥着非常重要的作用，这一新发现为研究家蚕物质生理代谢及其调控机制开辟了新领域。项目研究成果的取得，对于在本质上认识和了解家蚕Crz作用机制以及CrzR在家蚕生长发育、吐丝结茧等中的物质生理代谢及其调控机制等具有重要的科学意义，同时对于推进传统养蚕业的技术提升、提高经济效益等也将产生积极的作用。