mTOR信号通路在尿道狭窄发生中的作用及关键治疗靶点的筛选

Urethral stricture is a frequency source of male low urinary disorders and has been always a surgical challenge. Enlighted by the anti-fibrotic effect of rapamycin, an inhibiting effect of rapamycin on urethral stricture formation in rabbits was confirmed in our previous systematic study, inferring mTOR signal pathway may play an important role in urethral stricture formation. Here, to screen potential therapeutic targets, molecules in mTOR signal pathway were detected with PCR microarray in vitro and in vivo, which were identified in protein level with western-blot and co-immunoprecipitation. Then to further screen key therapeutic targets, expression of related molecules will be up/down regulated with drug, plasmid and siRNA, fibrosis formation will evaluated in vitro and in vivo. Our study will provide insight into the role of mTOR signal pathway in urethral stricture formation, and will systematically filtrate key therapeutic targets in mTOR signal pathway，achieving precision treatment of urethral stricture.

尿道狭窄是泌尿外科常见病，治疗棘手。受雷帕霉素抗纤维化的启发，我们前期通过较系统研究发现雷帕霉素对兔尿道狭窄具有明显抑制作用，提示mTOR（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路在尿道狭窄形成中可能具有重要意义。本研究拟通过PCR芯片技术从mRNA水平分别筛选尿道瘢痕组织、尿道瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路异常表达分子，并采用western-blot、免疫共沉淀等方法从蛋白质水平验证，筛选潜在治疗靶点分子；进一步通过药物、siRNA、质粒调节相关靶点分子表达，分别从细胞和动物模型水平评估纤维化发生情况变化，筛选关键治疗靶点分子。通过以上研究深入探讨mTOR信号通路在尿道狭窄形成过程中的作用，系统筛选mTOR信号通路关键治疗靶点，实现尿道狭窄的精准治疗。

尿道狭窄是由尿道成纤维细胞活化导致尿道纤维化引起的，当前治疗棘手，发病机制不清是其治疗瓶颈。其发生进展与多种细胞信号通路有关，这仍需进一步的研究和探索。本项目旨在明确mTOR信号通路和Notch信号通路与尿道纤维化发生进展的相关性；揭示mTOR抑制剂（OSI-027）和Notch抑制剂（DAPT）对尿道成纤维细胞活化的抑制作用；阐明mTOR抑制剂和Notch抑制剂抑制尿道成纤维细胞活化作用的分子机制。主要结果：TGFβ1对尿道成纤维细胞的细胞增殖无明显作用，但对尿道成纤维细胞的胶原合成具有促进作用；OSI-027具有更强的抑制尿道成纤维细胞的细胞增殖和胶原合成作用；OSI-027具有更强的抑制尿道成纤维细胞mTOR信号通路下游分子和TGFβ1信号通路下游分子表达作用；尿道狭窄组织中Notch信号通路处于激活状态；DAPT显著抑制了TGFβ1诱导的尿道成纤维细胞Notch信号通路、细胞增殖及细胞迁移；DAPT显著抑制了TGFβ1诱导的尿道成纤维细胞ECM合成，免疫共沉淀结果表明了尿道成纤维细胞NICD和Smad3的相互作用；DAPT对过表达NICD尿道成纤维细胞的细胞外基质蛋白表达抑制作用相对减弱；DAPT明显缓解了TGFβ1诱导的尿道纤维化，胶原沉积明显减少，纤维纤维束排列较规则， DAPT显著抑制了TGFβ1对尿道组织NICD、细胞外基质蛋白表达的增强作用。通过既定研究计划，明确了mTOR信号通路和Notch信号通路在尿道纤维化发生进展中的作用，发现并证实了mTOR信号通路和Notch信号通路具有抗尿道纤维化的作用靶点，为治疗尿道狭窄奠定了理论基础，为尿道狭窄的药物涂层尿管的设计及应用提供实验依据，具有较大的应用价值。