CRMP-2调控弥漫性轴索损伤后海马Aβ表达及学习记忆功能的机制研究

The learning and memory impairment is a serious long-term prognosis in diffuse axonal injury (DAI) patients, which costs huge economic and social loses. But until now the molecular mechanism underlie the impairment remain unclear. β-amyloid precursor protein（β-APP）can be decomposed by β-secretase into beta-amyloid protein(Aβ) after DAI. Then Aβ can destroy the structure and function of the α7 nAChR, causing learning and memory cognitive dysfunction. But the way how to regulate the β-secretase is unknown. This project intends to take collapsin response-mediator protein-2(CRMP-2) as a target to clarify whether CRMP-2 could regulate the status of β-secretion in the PI3K/Akt/GSK3β/CRMP signal path way through in vitro and vivo studies, and how it improves learning and memory impairment after DAI by regulating the expression of Aβ.

弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury,DAI）后的学习记忆障碍是患者长期存在的严重后遗症之一，其所产生的经济及社会损失尤其巨大，但其具体分子机制仍不清楚。有研究发现DAI后β-淀粉样前体蛋白通过β-分泌酶途径裂解形成β-淀粉样蛋白，继而破坏α7烟碱型受体的结构与功能，引起学习记忆等认知功能障碍。但在这一过程中，β-分泌酶是如何受到调控的，目前并未明确。本课题拟以脑衰反应调节蛋白2(collapsin response-mediator protein-2，CRMP-2)为靶点，通过体内体外的研究，明确在DAI损伤信号激活的PI3K/Akt/GSK3β/CRMP信号通路中，未磷酸化的CRMP-2是否可以通过调控β-分泌酶功能状态，进而调控、β-淀粉样蛋白的表达，改善DAI后的学习记忆障碍。

目的：探究创伤性脑损伤后脑衰反应调节蛋白2（Collapsin response mediator protein-2，CRMP2）影响学习记忆功能的机制。.方法：1、建立Thy1-GFP小鼠控制性皮层损伤（controlled cortical impact injury，CCI）模型，观察损伤后1天、7天树突棘密度和形态变化。2、应用免疫蛋白印迹和免疫荧光技术检测小鼠海马组织CRMP2在损伤后1天、7天的表达情况。3、构建CRMP2过表达和敲减质粒，对体外培养的神经元进行钙转，观察其对神经元树突棘的影响。4、通过立体定向注射技术分别向ICR小鼠海马区注射空载体病毒、CRMP2过表达病毒、CRMP2敲减病毒，4周后进行CCI损伤，并于损伤后7天观察海马区神经元树突棘的修复情况。5、检测小鼠条件性恐惧行为学实验中僵直时间和僵直次数，观察过表达CRMP2及敲减CRMP2对TBI后小鼠学习和记忆功能的影响。结果：1、损伤后1天，Thy1-GFP小鼠海马及皮层区树突棘密度减低，以蘑菇型和瘦长型丢失为主。在TBI后7天，树突棘密度增加，以瘦长型增加为主。2、CRMP2本体蛋白量在TBI后1天减低，其降解产物增加；在TBI后7天，CRMP2降解产物减少，其本体蛋白量增加。3、通过转染体外培养的神经元，发现CRMP2可以增加神经元树突棘密度，而CRMP2-shRNA可降低神经元树突棘密度。4、在体内实验中，与假损伤+空病毒组相比，TBI+空病毒组神经元树突棘密度无统计学差异，而分析树突棘分类发现瘦长型树突棘增加，蘑菇型树突棘减少；与TBI+空病毒组相比，TBI+CRMP2-shRNA组树突棘密度降低，瘦长型及蘑菇型树突棘密度均降低。TBI+CRMP2过表达组神经元树突棘密度增高，以蘑菇型树突棘为主。5、在TBI后7天，相比于假损伤+空病毒组，TBI+空病毒组的僵直时间和僵直次数仍较低。与TBI+空病毒组相比，TBI+CRMP2-shRNA组小鼠的僵直时间及僵直次数更低，而TBI+CRMP2过表达组僵直时间和僵直次数均较高。结论：CRMP2可以促进TBI后树突棘的再生和修复，改善学习和记忆功能障碍。